La selección de columnas es el primer y más importante paso para el desarrollo de un método analítico, tanto si se trata de cromatografía de gases como de cromatografía líquida de alto rendimiento. No es posible desarrollar un método robusto, robusto y reproducible sin columnas HPLC estables y de alto rendimiento. Significativamente, las columnas son reproducibles y estables para evitar errores con tiempo de retención de muestras irrelevantes durante el desarrollo del método HPLC.
La columna RP-HPLC se selecciona en función de la naturaleza de la molécula y la información sobre el soluto. La cromatografía en fase inversa es el tipo de HPLC que tienen un amplio rango de columnas como dimetilsilano (C2), butilosilano (C4), octilsalán (C8), octadecilsaleno (C18), cianopropilo, fenilo BDS y nitro, etc. En C18 o La columna C8 está hecha especialmente con sílice pura de alta calidad y menos ácida y es especialmente adecuada para el aislamiento de analitos básicos. Normalmente son adecuados para todas las muestras y los cromatógrafos les recomiendan mucho.
Los siguientes puntos dan orientación en la selección de columna para RP-HPLC:
- Casi todas las columnas HPLC están hechas de acero. La principal ventaja del acero es que es relativamente inerte a la corrosión y resistencia a la presión.
- Es significativo para una mejor separación de los solutos que no exista puntuación, rugosidad, dentro de una columna cromatográfica.
- El gel de sílice es la fase estacionaria más popular de la cromatografía líquida de alto rendimiento, que consta de átomos de Si y átomos de oxígeno y lleva grupos OH (grupos silanol). Está disponible en diferentes tamaños de partículas y se utiliza dentro de un rango de pH de 1,00 a 8,00.
- Las columnas basadas en polímeros también se utilizan en HPLC de fase inversa, proporcionando una estabilidad de pH mayor que las columnas de gel de sílice. Puede utilizarse para el aislamiento de componentes muy ácidos o básicos.
- Los materiales de embalaje de columnas de diferentes tipos y tamaños están disponibles según la naturaleza del compuesto y el método HPLC.
1. Las partículas totalmente porosas son las formas más utilizadas en la columna HPLC, que están disponibles en 3, 5 o 10 μm.
2. Las partículas del núcleo tienen un núcleo sólido y el armazón exterior es poroso, lo que resulta en una mejora de la eficiencia en la separación. Una de las principales desventajas de las partículas del núcleo es que poseen una baja capacidad de carga en comparación con los materiales porosos.
3. La columna de fase monolítica consta de un pedazo de material poroso, como un gel de sílice. Una desventaja de las fases monolíticas es que la disponibilidad de selectividad está limitada en contraste con los materiales totalmente porosos.
- Las columnas más largas por lo general dan una mejor separación debido a los números de placas teóricos más altos. Si el tamaño de la partícula disminuye, aumenta la superficie disponible para el recubrimiento. Las columnas HPLC de tamaño de partículas de 5 μm ofrecen la mejor solución en términos de eficiencia de reproducibilidad y fiabilidad.
La C18 es la columna de fase inversa más común que puede utilizarse en diversos análisis. Para decidir qué fase estacionaria o columna es adecuada, la columna C18 se considera la primera opción al principio del desarrollo del método. Al tener cadenas de carbono más largas (normalmente 18 carbonos) que otras columnas y proporciona una amplia superficie que ofrece un tiempo adicional de reacción entre las fases unidas. La molécula muy polar no interacciona con el material C18 y se eluce en el tiempo muerto, en estos casos puede utilizar fases C4, CN, diol o fenil. Por el contrario, si las moléculas son muy poco polares, puede utilizar sílice, CN o fase NH2.
Durante el desarrollo del método HPLC, hay algunos aspectos a tener en cuenta: esquema de separación, fase móvil, tipos de columna HPLC, diámetro de la columna (como el tamaño de la partícula, el tamaño de los poros, el diámetro interno, el diámetro y el contenido de carbono), analitos de interés, valor de pKa, pH del sistema disolvente, detector e inyector, etc. El desarrollo del método tiene condiciones distintas en cada caso; cada cromatógrafo debería tener en cuenta estos factores a la hora de realizar el análisis HPLC.
Las preguntas más frecuentes de la columna en HPLC son las siguientes.
¿Cuántos tipos de columnas HPLC existen?
Existen cuatro tipos principales de columnas HPLC: columna HPLC de fase inversa, columna HPLC de fase normal, columna HPLC de exclusión de tamaño y columna HPLC de intercambio iónico.
¿La columna c18 es polar o no polar?
La columna C18 se utiliza en la cromatografía de fase inversa; está lleno de material no polar en comparación con la fase estacionaria polar.
¿Qué diferencia existe entre HPLC y RP-HPLC?
El HPLC es el tipo de cromatografía en el que RP-HPLC es los modos de HPLC más utilizados. HPLC significa cromatografía líquida de alto rendimiento y RP-HPLC significa cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa.
¿Qué diferencia existe entre las columnas HPLC c8 y c18?
Tanto C8 como C18 son los tipos de columnas utilizados en HPLC, la principal diferencia entre C8 y C18 es que C18 tiene 18 átomos de carbono mientras que C8 sólo tiene 8 átomos de carbono.
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