Cultura de lotes alimentados: definición, principio, proceso, tipos, aplicaciones, limitaciones

En pocas palabras, el cultivo por lotes es una modificación de la fermentación por lotes. En el cultivo por lotes, los nutrientes se agregan asépticamente; es un sistema semiabierto y el volumen del cultivo líquido en el biorreactor aumenta a medida que se añade el cultivo sistemáticamente. Un cultivo de lote alimentado es más productivo, rinde mejor con adiciones de nutrientes secuenciales controladas, permite densidades de células más altas y prolonga la síntesis del producto.

Las principales ventajas del lote alimentado sobre el cultivo por lotes son:

1. Síntesis de productos a largo plazo,
2. Aumentando el número de células y por tanto aumentando la cantidad de producto, que es proporcional a la concentración de biomasa, es posible obtener mayores eficiencias en el proceso,
3. Mayor rendimiento y productividad con adiciones de nutrientes secuenciales controladas,
4. Permite que el biorreactor se utilice en producción durante períodos no rentables cuando normalmente se prepararía para el siguiente lote.

En un proceso de lote alimentado, generalmente no es necesario eliminar el caldo durante todo el proceso de fermentación, pero la cantidad de nutrientes limitantes agregados determina la velocidad de reacción.

Figura: Símbolo de reactor discontinuo alimentado e El gráfico muestra el principio del cultivo discontinuo alimentado limitado en el sustrato con una fase discontinua inicial. Después del consumo inicial de sustrato, se inicia un suministro continuo y constante del sustrato. Fuente de la imagen: Wikipedia.

El cultivo alimentado por lotes tiene las siguientes ventajas de mención:

1. La represión de catabolitos y los efectos de Crabtree se pueden controlar limitando la concentración de sustrato.
2. La alta densidad celular de las células podría lograrse
3. Es posible aumentar la producción de metabolitos no relacionados con el crecimiento.
4. Cuando sea necesario, se puede reducir la viscosidad del caldo.
5. Permite la reposición de pérdidas de agua por evaporación.

Principio de cultivo de lote alimentado

• El proceso inicial es similar al cultivo por lotes, todos los sustratos se agregan al comienzo de la fermentación.
• El caldo de cultivo generalmente se recolecta solo al final del período operativo, total o parcialmente (el resto sirve como inóculo para el siguiente ciclo repetido)
• En el cultivo discontinuo alimentado, se agrega un sustrato gradualmente a medida que avanza la fermentación.
• Estos sustratos se agregan en pequeñas concentraciones durante la etapa de fabricación.
• Durante la operación hay una o más corrientes de alimentación pero ningún efluente.
• Para controlar el proceso de alimentación se miden muchos parámetros indirectos relacionados con el metabolismo de un sustrato ya que no es posible medir la concentración de sustrato de manera directa y continua.
• Así, el volumen del cultivo aumenta durante el curso de la operación hasta que el volumen está lleno.

Proceso de cultivo por lotes alimentados

• El proceso comenzará con la fermentación discontinua y consumirá sustrato, nutrientes y/o inductores.
• El medio fresco se agregará a través de una variedad de corrientes de alimentación.
• Los microorganismos se inoculan y cultivan mediante un proceso por lotes durante un período determinado, luego se agregan nutrientes al fermentador en incrementos durante el resto de la fermentación.
• Mediante la manipulación de las tasas de alimentación durante el funcionamiento, se agregan intermitente o continuamente al cultivo carbono, nitrógeno, fosfatos, nutrientes, precursores o inductores.
• Las estrategias comunes de alimentación son:
  • alimentación discontinua, obtenida por pulsos regulares o irregulares de los sustratos e
  • alimentación regular y continua de nutrientes diseñada en base a datos precalculados o en base al control de retroalimentación de variables medidas en línea asociadas con el crecimiento celular y el metabolismo
• Como resultado de la adición de nutrientes frescos, normalmente se produce una gran acumulación de biomasa durante el crecimiento exponencial.
• Por lo tanto, la fermentación por lotes alimentados es muy útil para los bioprocesos que buscan una alta densidad de biomasa o un alto rendimiento del producto cuando el producto deseado está relacionado positivamente con el crecimiento microbiano.
• La tasa de crecimiento puede controlarse mediante la concentración de sustrato para evitar la represión catabólica.
• Los productos se recogen sólo al final de la carrera.
• El volumen de cultivo aumenta durante el funcionamiento hasta que se llena el volumen.
• A continuación, se utiliza un modo de operación por lotes para obtener los resultados finales.

Tipos de cultivos por lotes alimentados

1. Cultivo de lote alimentado de volumen fijo

• Este procedimiento implica alimentar el sustrato limitante al reactor altamente concentrado para que no haya un aumento notable en el volumen.
• Para lograr un volumen de cultivo casi constante, el sustrato limitante del crecimiento debe ser alimentado como un líquido o gas concentrado, en forma purificada por diálisis o esterilización por radiación.
• Se utilizó un sistema de alimentación por lotes de volumen constante para arqueas hipertermófilas cultivadas en condiciones aeróbicas.

2. Cultivo de lote alimentado de volumen variable

• Es un tipo de fermentación discontinua alimentada que implica la adición de alimentación de sustrato que cambia el volumen de trabajo con el tiempo de fermentación.
• El cambio de volumen puede verse afectado por los requisitos del proceso, la disponibilidad de tiempo y el propósito del proceso de fermentación.
• En el proceso de volumen variable de lote alimentado, la estrategia de alimentación se puede decidir en función de opciones como las siguientes
  • Para el procesamiento por lotes, se puede usar una composición de medios similar.
  • A voluntad, solo se puede añadir el sustrato limitante, a una concentración similar a la utilizada para el procesamiento por lotes, a voluntad, mientras que el resto de los constituyentes del medio se pueden agregar al principio al mismo ritmo que el volumen total del reactor.
  • Se podría agregar sustrato limitado, en forma concentrada, a un ritmo lento para evitar una dilución excesiva del caldo de fermentación.

3. Cultivo discontinuo alimentado repetido o cíclico

• Durante este proceso, cuando la fermentación alcanza la fase estacionaria y no hay cambios significativos en el crecimiento celular (debido al agotamiento del sustrato o la inhibición del producto), se retira una cierta cantidad de caldo usado del fermentador, seguido de la adición de medio nutritivo nuevo.
• Con esta eliminación y adición, la concentración de sustrato aumenta en el fermentador, lo que da como resultado un aumento en la tasa de crecimiento específica.
• Sin embargo, la tasa de crecimiento específica vuelve a disminuir a medida que se consume el sustrato y se alcanza un estado casi estable.
• Se utilizó el cultivo por lotes repetido para optimizar las condiciones para la biosíntesis de penicilina G mediante el uso de una estrategia de alimentación con fósforo.

4. Proceso de lote único

• En el cultivo de un solo lote, la solución de alimentación se agrega durante el proceso de fermentación, pero el caldo gastado no se elimina.
• Por el contrario, el principal inconveniente de este método es que gran parte del caldo de fermentación no se utiliza hasta el final del proceso de alimentación por lotes.
• Por lo tanto, el volumen del reactor puede ser un factor limitante serio para la duración de la fermentación.

Aplicación del cultivo por lotes alimentados

Diversos productos producidos o intentados producir con técnicas de alimentación por lotes

Producto	Ejemplo
Aminoácidos	Ácido glutámico, lisina, tirosina, triptófano, alanina
antibióticos	candidina y candiesina; Cefalosporina C, clorotetraciclina, griseofulvina, penicilina, estreptomicina, tetraciclina, levadura para hornear
Enzimas	Celulasa, galactosidasa, isoamilasa, proteasa, β – amilasa, α – amilasa, β – galactosidasa, β – glucanasa, β – glucosidasa
Disolventes	Acetona, Butanol, Glicerol, 1,3-Propanediol
vitaminas	Riboflavina, vitamina B12
Masa celular microbiana bacterias levaduras	Cellulomonas sp., PseudomonasCandida boidinii, Candida utilis, Pichia farinose, Saccharomyces cerevisiae
Cultivo de células animales	Línea celular no GS NS0, hibridoma
Otro	Ácido acético, ácido cítrico, ácido giberélico, lípidos neutros, polihidroxialcanoato (PHA), dihidroxiacetona (DHA), interferón-γ humano, ácido clavulánico, poli-β-hidroxibutirato (PHB)

Limitaciones de la cultura de lotes alimentados

1. El microbio debe ser analizado antes de su cultivo para determinar sus requerimientos, su fisiología y su productividad.
2. Para iniciar la fermentación y desarrollar el proceso, se requiere una considerable habilidad del operador.
3. Un cultivo cíclico de lote alimentado debe diseñarse cuidadosamente para garantizar que las toxinas no se acumulen hasta niveles inhibitorios y que los nutrientes distintos de los incorporados en el medio de administración no se vean limitados si se ejecutan muchos ciclos.
4. Mayores costos de mano de obra y/o control dinámico del proceso para el proceso.
5. Las cantidades de los componentes a controlar deben estar por encima de los límites de detección de los equipos de medición disponibles.

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