Tipos de centrífuga y centrifugación (definición, principio, usos)

Definición de centrífuga

Una centrifugadora es un aparato que sirve para separar los componentes de una mezcla en función de su tamaño, su densidad, la viscosidad del medio y la velocidad del rotor.

• La centrífuga se utiliza habitualmente en los laboratorios para la separación de moléculas biológicas de un extracto crudo.
• En una centrifugadora, la muestra se mantiene en un rotor que gira alrededor de un punto fijo (eje), lo que provoca una fuerte fuerza perpendicular al eje.
• Hay diferentes tipos de centrífugas que se utilizan para la separación de diferentes moléculas, pero todas funcionan según el principio de la sedimentación.

Definición de centrifugación

La centrifugación es la técnica de separación de componentes en la que la fuerza centrífuga/aceleración hace que las moléculas más densas se desplacen hacia la periferia, mientras que las partículas menos densas se desplazan hacia el centro.

• El proceso de centrifugación se basa en la fuerza perpendicular que se crea cuando una muestra gira alrededor de un punto fijo.
• La velocidad de centrifugación depende del tamaño y la densidad de las partículas presentes en la solución.

Leer más: Centrifugación - Principio, tipos y aplicaciones

Imagen creada con biorender.com.

Fuerza centrífuga relativa (FCR)

• La fuerza centrífuga relativa es la medida de la fuerza de los rotores de diferentes tipos y tamaños.
• Es la fuerza que se ejerce sobre el contenido del rotor como resultado de la rotación.
• La FCR es la fuerza perpendicular que actúa sobre la muestra y que es siempre relativa a la gravedad de la tierra.
• La FCR de las distintas centrífugas puede utilizarse para comparar rotores, lo que permite seleccionar la mejor centrífuga para una función determinada.

La fórmula para calcular la fuerza centrífuga relativa (FCR) puede escribirse como

FCR (g Fuerza)= 1,118 × 10-5 × r × (RPM)2

donde r es el radio del rotor (en centímetros), y RPM es la velocidad del rotor en vueltas por minuto.

Rotores de centrífuga

Los rotores de las centrífugas son los dispositivos motores que alojan los tubos con las muestras. Los rotores de las centrífugas están diseñados para generar una velocidad de rotación que pueda provocar la separación de los componentes de una muestra. Hay tres tipos principales de rotores utilizados en una centrífuga, que son

1. Rotores de ángulo fijo

Figura: Rotores de ángulo fijo. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• Estos rotores sostienen los tubos de muestra en un ángulo de 45° con respecto al eje del rotor.
• En este tipo de rotor, las partículas golpean el lado opuesto del tubo, donde finalmente se deslizan hacia abajo y se recogen en el fondo.
• Son más rápidos que otros tipos de rotores, ya que la longitud del recorrido de los tubos aumenta.
• Sin embargo, como la dirección de la fuerza es diferente de la posición del tubo, algunas partículas pueden permanecer en los lados de los tubos.

2. Rotores de cubeta basculante/ Rotores horizontales

Figura: Rotores de cangilones basculantes o rotores horizontales. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• Los rotores de cubeta basculante mantienen los tubos en un ángulo de 90° mientras el rotor se balancea al iniciar el proceso.
• En este rotor, los tubos están suspendidos en los bastidores que permiten que los tubos se muevan lo suficiente para adquirir la posición horizontal.
• En este tipo de rotores, las partículas están presentes a lo largo de la dirección o la trayectoria de la fuerza que permite que las partículas se alejen del rotor hacia el fondo de los tubos.
• Como los tubos permanecen horizontales, el sobrenadante permanece como una superficie plana que permite separar las partículas depositadas del sobrenadante.

3. Rotores verticales

Figura: Rotores verticales. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• Los rotores verticales proporcionan la menor longitud de recorrido, el tiempo de ejecución más rápido y la mayor resolución de todos los rotores.
• En los rotores verticales, los tubos están en posición vertical durante el funcionamiento de la centrífuga.
• El rendimiento del rotor no es tan ideal, ya que la posición del tubo no se alinea con la dirección de la fuerza centrífuga.
• Como resultado, en lugar de asentarse, las partículas tienden a extenderse hacia la pared exterior de los tubos.
• Se utilizan habitualmente en la centrifugación isopícnica y de gradiente de densidad.

Tipos de rotores de centrífuga Video Lecture (nptelhrd)

Tipos de centrifugadoras

1. Centrífuga de sobremesa

Figura: Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 8 Centrífuga pequeña de sobremesa. Fuente de la imagen: Thermo Scientific.

• La centrífuga de sobremesa es una centrífuga compacta que se utiliza habitualmente en los laboratorios clínicos y de investigación.
• Está accionada por un motor eléctrico en el que los tubos giran alrededor de un eje fijo, lo que provoca una fuerza perpendicular a los tubos.
• Al ser muy compactos, son útiles en laboratorios pequeños con espacios reducidos.
• En el mercado existen diferentes variantes de centrífugas de sobremesa para diversos fines.
• Una centrífuga de sobremesa tiene un rotor con bastidores para los tubos de muestra y una tapa que cierra la unidad de trabajo de la centrífuga.

2. Centrífuga de flujo continuo

Figura: Disposición del equipo durante la centrifugación de flujo continuo. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• La centrífuga de flujo continuo es una centrífuga rápida que permite centrifugar grandes volúmenes de muestras sin afectar a la velocidad de sedimentación.
• Este tipo de centrífuga permite separar un gran volumen de muestras con una gran fuerza centrífuga, eliminando así la tediosa parte de vaciar y llenar los tubos en cada ciclo.
• Tienen un recorrido más corto que facilita el proceso de granulación de la parte sólida del sobrenadante, manteniendo así la velocidad del proceso.
• También tienen mayor capacidad, lo que ahorra tiempo al no tener que cargar y descargar la muestra una y otra vez como en las centrífugas tradicionales.
• Esta centrífuga puede centrifugar hasta 1 litro de muestras en un tiempo de 4 horas o menos.

3. Centrífuga de gas

Figura: Esquema de una centrífuga de gas con flujo en contracorriente, utilizada para separar isótopos de uranio. Fuente de la imagen: Wikipedia (Inductiveload).

• Una centrifugadora de gases es una centrifugadora utilizada explícitamente para la separación de gases en función de sus isótopos.
• Esta centrifugadora se basa en el mismo principio de la fuerza centrífuga que todas las demás centrifugadoras, en las que las moléculas se separan en función de sus masas.
• Esta centrifugadora se utiliza principalmente para la extracción y separación de uranio -235 y uranio-238.
• La centrífuga de gas funciona con el diseño eh del flujo continuo de gas que entra y sale de la centrífuga, a diferencia de otras centrífugas que trabajan por lotes.
• Estas centrifugadoras están dispuestas en cascada, de modo que los gases se separan en dos unidades en función de sus isótopos y luego pasan a la siguiente centrifugadora para su posterior procesamiento.
• Las centrífugas de gas han sustituido a otros métodos de difusión gaseosa, ya que proporcionan un rendimiento de concentración de los gases superior al de las técnicas anteriores.

4. Centrífuga de hematocrito

Figura: Centrífuga de hematocritos AHN myLab®. Fuente de la imagen: AHN Biotechnologie GmbH.

• Las centrífugas de hematocrito son centrífugas especializadas que se utilizan para determinar la fracción de volumen de los eritrocitos (RBC) en una muestra de sangre determinada.
• Esta centrífuga proporciona valores de hematocrito que pueden utilizarse para pruebas de bioquímica, inmunidad, análisis de sangre y otras pruebas clínicas generales.
• Las centrífugas de hematocritos pueden utilizarse para ayudar a diagnosticar la pérdida de sangre, la policitemia (elevación del recuento de eritrocitos a niveles superiores a los normales), la anemia, la insuficiencia de la médula ósea, la leucemia y el mieloma múltiple.
• La centrífuga de microhematocritos alcanza rápidamente velocidades de 11.000 rpm y FCR de hasta 15.000 g para centrifugar las muestras del tubo.
• Los componentes de una centrífuga de hematocritos son similares a los de la centrífuga de mesa, pero esta centrífuga está especializada en el uso de muestras de sangre.

5. Centrífuga de alta velocidad

Figura: Centrífuga de alta velocidad de la serie Avanti JXN-30. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• La centrífuga de alta velocidad, como su nombre indica, es la que puede funcionar a velocidades algo mayores.
• La velocidad de la centrífuga de alta velocidad puede oscilar entre 15.000 y 30.000 rpm.
• La centrífuga de alta velocidad se utiliza habitualmente en los laboratorios más sofisticados con la aplicación bioquímica y requiere una alta velocidad de operaciones.
• Las centrifugadoras de alta velocidad están provistas de un sistema de control de la velocidad y la temperatura del proceso, necesario para el análisis de moléculas biológicas sensibles.
• Las centrifugadoras de alta velocidad vienen con diferentes adaptadores para acomodar los tubos de muestra de varios tamaños y volúmenes.
• En estas centrífugas se pueden utilizar los tres tipos de rotores para el proceso de centrifugación.

6. Centrífuga de baja velocidad

Figura: Centrífugas de baja velocidad - ScanSpeed 406 y ScanSpeed 416. Fuente de la imagen: LaboGene.

• Las centrifugadoras de baja velocidad son las centrifugadoras tradicionales que se utilizan habitualmente en los laboratorios para la separación rutinaria de partículas.
• Estas centrífugas funcionan a una velocidad máxima de 4000-5000 rpm.
• Suelen funcionar a temperatura ambiente, ya que no disponen de un sistema para controlar la velocidad o la temperatura de funcionamiento.
• En estas centrífugas se pueden utilizar rotores del tipo de cubeta basculante y de ángulo fijo.
• Son centrifugadoras fáciles y compactas, ideales para el análisis de muestras de sangre y otras muestras biológicas.
• La centrífuga de baja velocidad funciona según el mismo principio que las demás centrífugas, pero su aplicación se limita a la separación de soluciones más simples.

7. Microcentrífuga

Figura: Microfuga 16 y Microfuga 20. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• Las microcentrífugas son las centrífugas utilizadas para la separación de muestras con volúmenes más pequeños, que van de 0,5 a 2 µl.
• Las microcentrífugas suelen funcionar a una velocidad de unas 12.000-13.000 rpm.
• Se utilizan para la separación molecular de orgánulos celulares, como los núcleos y el ADN, y para la extracción de fenol.
• Las microcentrífugas, también denominadas microfugas, utilizan tubos de muestra de menor tamaño en comparación con los tubos de ensayo estándar utilizados en centrífugas más grandes.
• Algunas microcentrífugas vienen con adaptadores que facilitan el uso de tubos más grandes junto con los más pequeños.
• Existen microcentrífugas con controles de temperatura para el funcionamiento de muestras sensibles a la temperatura.

8. Centrífugas refrigeradas

Figura: Centrífuga de sobremesa refrigerada Allegra 64R. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• Las centrífugas refrigeradas son las que disponen de un control de temperatura que va de -20°C a -30°C.
• Existe otra variante de centrifugadoras que dispone de un sistema de control de la temperatura que es esencial para diversos procesos que requieren temperaturas más bajas.
• Las centrífugas refrigeradas tienen una unidad de control de la temperatura, además de los rotores y las gradillas para los tubos de muestra.
• Estas centrífugas proporcionan una FCR de hasta 60.000 xg, ideal para la separación de diversas moléculas biológicas.
• Suelen utilizarse para recoger sustancias que se separan rápidamente, como células de levadura, cloroplastos y eritrocitos.
• La cámara de la centrífuga refrigerada está aislada del exterior para cumplir las condiciones de las operaciones.

9. Ultracentrífugas

Figura: Ultracentrífugas. Fuente de la imagen: Beckman Coulter, Inc.

• Las ultracentrífugas son las centrifugadoras que funcionan a velocidades extremadamente altas y que permiten la separación de moléculas mucho más pequeñas, como los ribosomas, las proteínas y los virus.
• Es el tipo de centrífuga más sofisticado que permite la separación de moléculas que no se pueden separar con otras centrífugas.
• En este tipo de centrifugadoras hay sistemas de refrigeración que ayudan a equilibrar el calor producido por el intenso giro.
• La velocidad de estas centrifugadoras puede alcanzar hasta 150.000 rpm.
• Puede utilizarse tanto para trabajos preparatorios como analíticos.
• Las ultracentrífugas pueden separar moléculas en grandes lotes y en un sistema de flujo continuo.
• Además de la separación, las ultracentrífugas también pueden utilizarse para determinar las propiedades de las macromoléculas, como el tamaño, la forma y la densidad.

10. Centrífuga de vacío/ Concentradores

Figura: Concentrador de vacío Savant™ SpeedVac™ SPD120 y kits. Fuente de la imagen: Thermo Scientific.

• La centrífuga de vacío utiliza la fuerza centrífuga, el vacío y el calor para acelerar la evaporación de las muestras en el laboratorio.
• Estas centrifugadoras son capaces de procesar un gran número de muestras (hasta 148 muestras a la vez).
• Este tipo de centrífuga se utiliza en los laboratorios químicos y biológicos para la evaporación eficaz de los disolventes presentes en las muestras, concentrando así las muestras.
• Se utilizan habitualmente en los laboratorios de alto rendimiento para las muestras que pueden tener un gran número de disolventes.
• Se utiliza un evaporador rotativo para eliminar los disolventes innecesarios y eliminar el choque de disolventes.
• La centrifugadora funciona reduciendo la presión de la cámara, lo que también disminuye el punto de ebullición de las muestras.
• Esto hace que los disolventes se evaporen, concentrando las partículas a separar.

Tipos de centrifugación

1. Centrifugación analítica

La centrifugación analítica es un método de separación en el que las partículas de una muestra se separan en función de su densidad y de la fuerza centrífuga que experimentan. La ultracentrifugación analítica (AUC) es un método versátil y robusto para el análisis cuantitativo de macromoléculas en solución.

Principio de la centrifugación analítica

• La centrifugación analítica se basa en el principio de que las partículas que son más densas que otras se asientan más rápidamente. Del mismo modo, las moléculas más grandes se mueven más rápidamente por la fuerza centrífuga que las más pequeñas.
• La ultracentrifugación analítica para la determinación de la masa molecular relativa de una macromolécula puede realizarse mediante un enfoque de velocidad de sedimentación o una metodología de equilibrio de sedimentación.
• Las propiedades hidrodinámicas de las macromoléculas se describen mediante sus coeficientes de sedimentación. Pueden determinarse a partir de la velocidad a la que se mueve un límite de concentración de las biomoléculas concretas en el campo gravitatorio.
• El coeficiente de sedimentación puede utilizarse para caracterizar los cambios de tamaño y forma de las macromoléculas al cambiar las condiciones experimentales.
• Existen tres sistemas ópticos para la ultracentrífuga analítica (absorbancia, interferencia y fluorescencia) que permiten una observación precisa y selectiva de la sedimentación en tiempo real.

Pasos de la centrifugación analítica

• Tamaños de muestra pequeños (20-120 mm³) se toman en células analíticas para colocarlas dentro de la ultracentrífuga.
• A continuación, la ultracentrífuga se hace funcionar de forma que la fuerza centrífuga provoque una migración de las biomoléculas distribuidas aleatoriamente a través del disolvente de forma radial hacia fuera del centro de rotación.
• La distancia de las moléculas al centro se determina mediante el sistema óptico de Schlieren.
• Se traza un gráfico de la concentración de soluto frente a la distancia radial al cuadrado desde el centro de rotación, a partir del cual se determina la masa molecular.

Utiliza de la centrifugación analítica

• La centrifugación analítica puede utilizarse para determinar la pureza de las macromoléculas.
• También puede utilizarse para examinar los cambios en la masa molecular de los complejos supramoleculares.
• Además, permite determinar la masa molecular relativa de los solutos en su estado nativo.

2. Centrifugación en gradiente de densidad

La centrifugación en gradiente de densidad es la separación de moléculas en la que la separación se basa en la densidad de las moléculas al pasar por un gradiente de densidad bajo una fuerza centrífuga.

Principio de la centrifugación en gradiente de densidad

• La centrifugación en gradiente de densidad se basa en el principio de que las moléculas se asientan bajo una fuerza centrífuga hasta alcanzar un medio con la misma densidad que la suya.
• En este caso, se emplea un medio con un gradiente de densidad, que tiene que disminuir la densidad o aumentar la densidad.
• Las moléculas de una muestra se mueven a través del medio cuando la muestra gira creando una fuerza centrífuga.
• Las moléculas más densas comienzan a desplazarse hacia el fondo a medida que se mueven por el gradiente de densidad.
• Las moléculas quedan entonces suspendidas en un punto en el que la densidad de las partículas es igual a la del medio circundante.
• De este modo, las moléculas con diferentes densidades se separan en diferentes capas que luego pueden recuperarse mediante diversos procesos.

Pasos de la centrifugación en gradiente de densidad

• Un gradiente de densidad de un medio se crea colocando suavemente la concentración más baja sobre las concentraciones más altas en un tubo de centrífuga.
• A continuación, se coloca la muestra sobre el gradiente y se introducen los tubos en una ultracentrífuga.
• Las partículas se desplazan por el gradiente hasta que alcanzan un punto en el que su densidad coincide con la del medio circundante.
• Las fracciones se retiran y se separan, obteniendo las partículas como unidades aisladas.

Usos de la centrifugación en gradiente de densidad

• La centrifugación en gradiente de densidad puede aplicarse para la purificación de grandes volúmenes de biomoléculas.
• Incluso puede utilizarse para la purificación de diferentes virus, lo que facilita su estudio posterior.
• Esta técnica puede utilizarse tanto como técnica de separación como de determinación de densidades de diversas partículas.

Ejemplos de centrifugación en gradiente de densidad

• Este método se utilizó en el famoso experimento que demostró que el ADN es semiconservativo utilizando diferentes isótopos de nitrógeno.
• Otro ejemplo es el uso de esta técnica para el aislamiento de la fracción microsomal de los homogeneizados musculares y la posterior separación de las vesículas de membrana con una densidad diferente.

3. Centrifugación diferencial

La centrifugación diferencial es un tipo de proceso de centrifugación en el que los componentes se asientan por separado en un tubo de centrifugación aplicando una serie de fuerzas centrífugas crecientes.

Principio de la centrifugación diferencial

• La centrifugación diferencial se basa en las diferencias en la velocidad de sedimentación de partículas biológicas de diferente tamaño y densidad.
• Al aplicar una fuerza centrífuga creciente, se produce una sedimentación inicial de las moléculas más grandes.
• Otras partículas se sedimentan en función de la velocidad y el tiempo de los distintos pasos de centrifugación y de la densidad y el tamaño relativo de las partículas.
• La clase más grande de partículas forma un pellet en el fondo del tubo de centrifugado, dejando estructuras de menor tamaño dentro del sobrenadante.
• Así, las moléculas más grandes sedimentan rápidamente y con fuerzas centrífugas más bajas, mientras que las moléculas más pequeñas necesitan más tiempo y fuerzas más altas.
• En el caso de partículas menos densas que el medio, las partículas flotarán en lugar de sedimentarse.

Pasos de la centrifugación diferencial

• La solución de la muestra se homogeneiza en el medio que contiene el tampón.
• A continuación, la muestra se coloca en el tubo de centrifugación, que se hace funcionar con una fuerza centrífuga determinada durante un tiempo específico y a una temperatura determinada.
• Al final de esta operación, se formará un pellet en el fondo del tubo, que se separa del sobrenadante.
• El sobrenadante se añade a un nuevo tubo de centrífuga donde se centrifuga a otra velocidad durante un tiempo y una temperatura determinados.
• De nuevo, el sobrenadante se separa de los gránulos formados.
• Se continúa con estos pasos hasta que todas las partículas estén separadas entre sí.
• A continuación, las partículas pueden identificarse mediante el análisis de los indicadores que son exclusivos de las partículas específicas.

Usos de la centrifugación diferencial

• La centrifugación diferencial se utiliza habitualmente para la separación de los orgánulos y las membranas que se encuentran en la célula.
• También puede utilizarse para la separación de baja resolución del núcleo.
• Como esta técnica separa las partículas en función de su tamaño, puede utilizarse para la purificación de extractos que contienen impurezas de mayor tamaño.

4. Centrifugación isopícnica

La centrifugación isopícnica es un tipo de centrifugación en el que las partículas de una muestra se separan en función de sus densidades al aplicar la fuerza centrífuga a la muestra.

Principio de la centrifugación isopícnica

• La centrifugación isopícnica también se denomina centrifugación de equilibrio, ya que la separación de las partículas se produce únicamente en función de sus densidades y no de sus tamaños.
• Las partículas se mueven hacia el fondo, y el movimiento se basa en el tamaño de las partículas. Y el flujo cesa cuando la densidad de la partícula se iguala a la del medio circundante.
• La densidad en el gradiente aumenta a medida que nos desplazamos por el tubo hacia el fondo. En consecuencia, las partículas de mayor densidad se depositan en el fondo, seguidas de partículas menos densas que forman bandas por encima de las partículas más densas.
• Se considera un verdadero equilibrio, ya que éste depende directamente de las densidades de flotación y no de los tamaños de las partículas.

Pasos de la centrifugación isopícnica

• Se prepara un gradiente con una densidad creciente hacia el fondo del tubo. También se puede utilizar un gradiente ya preparado.
• La solución de la muestra biológica y la sal se distribuye uniformemente en el tubo de centrífuga y se coloca dentro de la centrífuga.
• Una vez que la centrífuga está en funcionamiento, se forma un gradiente de densidad de la sal en el tubo.
• Las partículas se desplazan por el tubo y se asientan al llegar a la región con sus respectivas densidades.
• A continuación, las partículas se separan y se identifican mediante otros procesos diferentes.

Usos de la centrifugación isopícnica

• La centrifugación isopícnica puede aplicarse para la purificación de grandes volúmenes de biomoléculas.
• Esta técnica puede utilizarse para determinar las densidades de diversas partículas.

5. Centrifugación en gradiente de densidad zonal/ Centrifugación en zona móvil

La centrifugación de gradiente de densidad zonal es un tipo de centrifugación que separa las partículas en función de su forma como de su tamaño y funciona según el mismo principio de la centrifugación de gradiente de densidad, pero de forma diferente. También se denomina centrifugación de zona móvil.

Principio de la centrifugación en gradiente de densidad zonal

• La centrifugación zonal de velocidad fracciona las partículas tanto por su tamaño como por su forma.
• El procedimiento consiste en estratificar una muestra en una zona restringida sobre un gradiente de densidad previamente vertido. A continuación se centrifuga el gradiente de densidad.
• Todas las partículas migran hacia el gradiente de densidad porque éste sólo tiene densidades mucho más bajas que las de las partículas que se centrifugan.
• Las partículas se fraccionan principalmente por su tamaño y forma. Cuanto más grande es una partícula, más rápidamente sedimenta.
• Cuanto más esférica es una partícula, más rápidamente sedimenta.
• Las partículas sedimentan a través del gradiente a una velocidad que es función de su coeficiente de sedimentación.
• A diferencia de la centrifugación diferencial, en la que la muestra se distribuye por todo el medio, en la centrifugación de velocidad zonal, la muestra está presente inicialmente sólo en la parte superior del gradiente como una banda estrecha.

Pasos de la centrifugación en gradiente de densidad zonal

• Se prepara un gradiente de densidad en un tubo de centrífuga antes de aplicar la muestra.
• A continuación, se coloca la misma sobre el gradiente en forma de banda.
• Durante la centrifugación, las partículas de movimiento rápido (de mayor tamaño y forma circular) se desplazan por delante de las partículas más lentas, de modo que las diferentes partículas se separan en forma de bandas en diferentes partes del gradiente.
• Las partículas se separan en función de sus coeficientes de sedimentación, y se obtienen del fondo del tubo a través de una perforación.

Usos de la centrifugación en gradiente de densidad zonal

• La centrifugación diferencial tasa-zona se ha utilizado para la separación de virus, ya que tienen componentes de diferente tamaño y densidad que son únicos para cada virus.
• Este método se ha empleado para el fraccionamiento del ARN en gradientes de sacarosa.
• Además, la centrifugación diferencial zonal también se ha utilizado para la separación, purificación y fraccionamiento de moléculas de ADN tanto de virus como de bacterias.
• El fraccionamiento de polisomas y subunidades de ribosomas ha sido una de las primeras aplicaciones de este método.

6. Centrifugación de velocidad diferencial (límite móvil)

La centrifugación de velocidad diferencial es un tipo de proceso de centrifugación en el que los componentes se asientan por separado en un tubo de centrifugación aplicando una serie de velocidades crecientes.

Principio de la centrifugación de velocidad diferencial (límite móvil)

• La centrifugación diferencial se basa en las diferencias en la velocidad de sedimentación de partículas biológicas de diferente tamaño y densidad.
• Al aumentar la velocidad de los rotores, se produce una sedimentación inicial de las moléculas más grandes.
• Otras partículas se sedimentan en función de la velocidad y el tiempo de los distintos pasos de centrifugación y de la densidad y el tamaño relativo de las partículas.
• La clase más grande de partículas forma un pellet en el fondo del tubo de centrifugado, dejando estructuras de menor tamaño dentro del sobrenadante.
• A continuación, se retira el pellet y se vuelve a centrifugar el sobrenadante para obtener partículas más pequeñas.
• Así, las moléculas más grandes sedimentan rápidamente y a menor velocidad, mientras que las moléculas más pequeñas tardan más tiempo y a mayor velocidad.
• En el caso de partículas menos densas que el medio, las partículas flotarán en lugar de sedimentar.

Pasos de la centrifugación de velocidad diferencial (límite móvil)

• La solución de la muestra se homogeneiza en el medio que contiene el tampón.
• A continuación, la muestra se coloca en el tubo de centrifugación, que se hace funcionar a una velocidad de rotor inferior durante un tiempo determinado y a una temperatura determinada.
• Al final de esta operación, se formará un pellet en el fondo del tubo, que se separa del sobrenadante.
• El sobrenadante se añade a un nuevo tubo de centrífuga donde se centrifuga a otra velocidad durante un tiempo y una temperatura determinados.
• De nuevo, el sobrenadante se separa de los gránulos formados.
• Se continúa con estos pasos hasta que todas las partículas estén separadas entre sí.
• A continuación, las partículas pueden identificarse mediante el análisis de los indicadores que son exclusivos de las partículas específicas.

Usos de la centrifugación de velocidad diferencial (límite móvil)

• La centrifugación diferencial se utiliza habitualmente para la separación de los orgánulos y las membranas que se encuentran en la célula.
• También puede utilizarse para la separación de baja resolución del núcleo.
• Como esta técnica separa las partículas en función de su tamaño, puede utilizarse para la identificación y comparación de partículas de diferentes tamaños.

7. Centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio

La centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio es una forma modificada y especializada de centrifugación en gradiente de densidad.

Principio de la centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio

• La centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio se basa en el principio de que las partículas de una solución se separan en función de sus densidades.
• En este caso, las partículas se mueven a través del gradiente de densidad y se detienen en una región en la que la densidad del medio es igual a la densidad de la partícula.
• En este punto, la fuerza centrífuga que actúa sobre la partícula es igual a la fuerza de flotación que empuja las partículas hacia arriba. Como resultado, las partículas dejan de moverse y pueden separarse en diferentes capas.
• La densidad en el gradiente aumenta a medida que descendemos por el tubo hacia el fondo. Como resultado, las partículas de mayor densidad se depositan en el fondo, seguidas de partículas menos densas que forman bandas por encima de las partículas más densas.

Pasos de la centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio

• Se prepara un gradiente con una densidad creciente hacia el fondo del tubo. También se puede utilizar un gradiente ya preparado.
• La solución de la muestra biológica y la sal se distribuye uniformemente en el tubo de centrífuga y se coloca dentro de la centrífuga.
• Una vez que se pone en funcionamiento la centrifugadora, se forma un gradiente de densidad de la sal en el tubo.
• Las partículas se desplazan por el tubo y se asientan al llegar a la región con sus respectivas densidades.
• A continuación, las partículas se separan y se identifican mediante otros procesos diferentes.

Usos de la centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio

• La centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio puede aplicarse para la purificación de grandes volúmenes de biomoléculas.
• Esta técnica puede utilizarse para determinar las densidades de diversas partículas.

Ejemplos de centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio

• Se ha utilizado en los experimentos realizados por Meelson y Stahl para determinar las densidades de diferentes moléculas de ADN en función del lugar al que llegaban en el gradiente de densidad.

8. Centrifugación en gradiente de sacarosa

La centrifugación en gradiente de sacarosa es un tipo de centrifugación en gradiente de densidad en el que el gradiente de densidad se forma de sacarosa cambiando la concentración de ésta.

Principio de la centrifugación en gradiente de sacarosa

• La centrifugación en gradiente de sacarosa se basa en el principio de que las moléculas se asientan bajo una fuerza centrífuga hasta alcanzar un medio con la misma densidad que la suya.
• En este caso, se emplea un medio con gradiente de sacarosa, que tiene una densidad menor en la parte superior y mayor en la inferior.
• Las moléculas de una muestra se mueven a través del medio cuando la muestra gira creando una fuerza centrífuga.
• Las moléculas más densas comienzan a desplazarse hacia el fondo a medida que se mueven por el gradiente de densidad.
• Las moléculas quedan entonces suspendidas en un punto en el que la densidad de las partículas es igual a la del medio circundante.
• De este modo, las moléculas con diferentes densidades se separan en diferentes capas que luego pueden recuperarse mediante diversos procesos.

Pasos de la centrifugación en gradiente de sacarosa

• Se crea un gradiente de densidad de sacarosa colocando suavemente la concentración más baja de sacarosa sobre las concentraciones más altas en un tubo de centrífuga.
• A continuación, se coloca la muestra sobre el gradiente y se introducen los tubos en una ultracentrífuga.
• Las partículas se desplazan por el gradiente hasta que alcanzan un punto en el que su densidad coincide con la del medio circundante.
• Las fracciones se retiran y se separan, obteniendo las partículas como unidades separadas.

Usos de la centrifugación en gradiente de sacarosa

• La centrifugación en gradiente de sacarosa es una potente técnica para la separación de macromoléculas como el ADN y el ARN.
• También se ha utilizado para el análisis de complejos proteicos y para determinar la densidad y el tamaño de otras macromoléculas.

Vídeo de la teoría de la centrifugación (Dr. Alankar Shrivastava)

Referencia

1. Wilson, K., Walker, J. (2018). Principios y Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. Octava edición. Cambridge University Press: Nueva York.
2. Serwer, BACTERIOFAGO: SEPARACIÓN DE, Editor(es): Ian D. Wilson, Enciclopedia de la Ciencia de la Separación, Academic Press, 2000, Páginas 2102-2109,
3. ISBN 9780122267703, https://doi.org/1016/B0-12-226770-2/07381-6. (http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B0122267702073816)
4. https://www.beckman.com/resources/fundamentals/principles-of-centrifugation/rotor-types
5. https://www.beckman.com/centrifuges/rotors/vertical-angle
6. https://www.beckman.com/resources/reading-material/application-notes/principles-of-continuous-flow-centrifugation
7. http://origin.who.int/medical_devices/innovation/hospt_equip_8.pdf
8. https://www.news-medical.net/Life-Science-and-Laboratory/Microcentrifuges
9. https://www.mybiosource.com/learn/testing-procedures/rate-zonal-centrifugation/

Fuentes

• 2% - https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/rate-zonal-centrifugation
• 1% - https://www.who.int/medical_devices/innovation/hospt_equip_8.pdf
• 1% - https://www.slideshare.net/SrinivasKandhan/ultracentrifugation-81242908
• 1% - https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/zonal-centrifugation
• 1% - https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X07840064
• 1% - https://www.researchgate.net/post/The_key_point_of_sucrose_density_gradient_centrifugation_experiment
• 1% - https://www.phys.sinica.edu.tw/TIGP-NANO/Course/2007_Spring/Class%20Notes/AC_Chapter%203%20Centrifugation%200321.pdf
• 1% - https://scholars.unh.edu/faculty_pubs/818/
• <1% - https://www.wikihow.com/Calculate-Wind-Load
• <1% - https://www.vapor-dryer.com/news/the-difference-between-high-speed-centrifuge-a-20249769.html
• <1% - https://www.thoughtco.com/what-is-centripetal-force-4120804
• <1% - https://www.slideshare.net/rakshmitharakshmitha/differential-centrifugation
• <1% - https://www.slideshare.net/khadeejaikram56/centrifugation-49732927
• <1% - https://www.slideshare.net/georgeoajr/density-gradient-centrifugation
• <1% - https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biofiles/centrifugation-separations.html
• <1% - https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/immunoassay
• <1% - https://www.sciencedirect.com/topics/chemistry/centrifugation
• <1% - https://www.sciencedirect.com/topics/chemical-engineering/centrifugation
• <1% - https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/sedimentation-equilibrium
• <1% - https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/density-gradient
• <1% - https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/polysome
• <1% - https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0075753508706284
• <1% - https://www.researchgate.net/publication/6464185_Complete_blood_count_clinical_chemistry_and_serology_profile_by_using_a_single_tube_of_whole_blood_from_mice
• <1% - https://www.researchgate.net/post/What_is_the_difference_between_the_G_and_the_RPM_in_Centrifugae_Machine_Is_it_same_or_what_Does_it_have_any_specific_formula_for_conversion
• <1% - https://www.researchgate.net/post/How_can_I_get_bacteria_pellet_using_centrifuge
• <1% - https://www.pluriselect.com/products/density-gradient-centrifugation/density-gradient-media.html
• <1% - https://www.pharmacistdunia.com/2018/07/principle-of-centrifugation.html
• <1% - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3967015/
• <1% - https://www.nature.com/articles/srep27494
• <1% - https://www.mybiosource.com/learn/testing-procedures/rate-zonal-centrifugation/
• <1% - https://www.microscopemaster.com/laboratory-centrifuge.html
• <1% - https://www.jove.com/science-education/5685/density-gradient-ultracentrifugation
• <1% - https://www.imbb.forth.gr/ProFI/pdf/Aebersold2007_N%20Reviews_Protein%20complexes_MS.pdf
• <1% - https://www.hettweb.com/applications/hematocrit/
• <1% - https://www.flinnsci.com/globalassets/flinn-scientific/higher-education/centrifuge-resource-guide.pdf
• <1% - https://www.fishersci.se/se/en/scientific-products/centrifuge-guide/centrifugation-theory.html
• <1% - https://www.fishersci.co.uk/gb/en/scientific-products/centrifuge-guide/centrifugation-theory.html
• <1% - https://www.djblabcare.co.uk/djb/product/1241/Centrifuges-75005297-Sorvall_Contifuge_Stratos
• <1% - https://www.deepdyve.com/lp/elsevier/biophysical-studies-by-ultracentrifugation-MZ1mvpbp4R
• <1% - https://www.biologydiscussion.com/biochemistry/centrifugation/methods-used-for-separation-of-particles-in-centrifugation-3-methods/12453
• <1% - https://www.beckman.com/centrifuges/rotors/vertical-angle
• <1% - https://www.beckman.com/centrifuges/high-speed
• <1% - https://www.aplustopper.com/relative-atomic-mass-relative-molecular-mass-element/
• <1% - https://www.answers.com/Q/What_separates_a_mixture_by_particle_size
• <1% - https://www.analytica-world.com/en/whitepapers/123157/field-flow-fractionation-the-universal-separation-principle-for-particle-and-macromolecule-characterization.html
• <1% - https://wiki2.org/en/Centrifugation
• <1% - https://upendrats.blogspot.com/2011/12/centrifugation-separating-technique.html
• <1% - https://quizlet.com/50902778/basic-electric-motors-flash-cards/
• <1% - https://pediaa.com/difference-between-preparative-and-analytical-centrifugation/
• <1% – https://link.springer.com/article/10.1007/BF02869844
• <1% – https://link.springer.com/article/10.1007/BF00860607
• <1% - https://en.wikipedia.org/wiki/Isopycnic
• <1% - https://en.wikipedia.org/wiki/Gradient
• <1% - https://en.wikipedia.org/wiki/Differential_centrifugation
• <1% - https://en.wikipedia.org/wiki/Centrifuge
• <1% - https://en.m.wikipedia.org/wiki/Gas_centrifuge
• <1% - https://embryo.asu.edu/pages/equilibrium-density-gradient-centrifugation-cesium-chloride-solutions-developed-matthew
• <1% - https://biology.stackexchange.com/questions/57386/are-vacuum-centrifuges-the-same-as-normal-centrifuges
• <1% - https://answers.yahoo.com/question/index?qid=20070225221138AAgtJsO
• <1% - http://www.thermofishersci.in/lit/Labconco%20Centrifugal%20Vacuum%20Concentrators.pdf
• <1% - http://www.authorstream.com/Presentation/satyanarayana12345-3004825-size-seperation-pharmaceutics/
• <1% - http://irdbalancing.com/phone/types-of-rotors.html
• <1% - http://farside.ph.utexas.edu/teaching/302l/lectures/node72.html