Centrifugación - Principio, tipos y aplicaciones

• La centrifugación es una técnica de separación de sustancias que implica la aplicación de una fuerza centrífuga.
• Las partículas se separan de una solución según su tamaño, forma, densidad, la viscosidad del medio y la velocidad del rotor.

Principio de la centrifugación

• En una solución, las partículas cuya densidad es mayor que la del disolvente se hunden (sedimentan), y las partículas más ligeras que éste flotan hacia arriba.
• Cuanto mayor es la diferencia de densidad, más rápido se mueven. Si no hay diferencia de densidad (condiciones isopícnicas), las partículas permanecen estables.
• Para aprovechar incluso las pequeñas diferencias de densidad para separar las distintas partículas de una solución, se puede sustituir la gravedad por la "fuerza centrífuga", mucho más potente, que proporciona una centrifugadora.
• Una centrifugadora es un equipo que pone un objeto en rotación alrededor de un eje fijo (lo hace girar en círculo), aplicando una fuerza potencialmente fuerte perpendicular al eje de giro (hacia fuera).
• La centrifugadora funciona según el principio de sedimentación, en el que la aceleración centrípeta hace que las sustancias y partículas más densas se desplacen hacia el exterior en dirección radial.
• Al mismo tiempo, los objetos menos densos se desplazan y se mueven hacia el centro.
• En una centrifugadora de laboratorio que utiliza tubos de muestra, la aceleración radial hace que las partículas más densas se depositen en el fondo del tubo, mientras que las sustancias de baja densidad suben a la parte superior.

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Fuente de la imagen: Sepmag

Tipos de centrífugas

CENTRÍFUGA DE BAJA VELOCIDAD

1) La mayoría de los laboratorios tienen una centrifugadora estándar de baja velocidad que se utiliza para la sedimentación rutinaria de partículas pesadas

2) La centrífuga de baja velocidad tiene una velocidad máxima de 4000-5000rpm

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3) Estos instrumentos suelen funcionar a temperatura ambiente, sin medios de control de la temperatura. 4) Se utilizan dos tipos de rotores,

• De ángulo fijo
• Cubo basculante.

5) Se utiliza para la sedimentación de los glóbulos rojos hasta que las partículas estén bien empaquetadas en un pellet y el sobrenadante se separe por decantación.

CENTRIFUGADORAS DE ALTA VELOCIDAD

1. Las centrífugas de alta velocidad se utilizan en las aplicaciones bioquímicas más sofisticadas, en las que son esenciales una mayor velocidad y el control de la temperatura de la cámara del rotor.
2. La centrífuga de alta velocidad tiene una velocidad máxima de 15.000 - 20.000 RPM
3. El operador de este instrumento puede controlar cuidadosamente la velocidad y la temperatura, lo que es necesario para las muestras biológicas sensibles.
4. Existen tres tipos de rotores para la centrifugación de alta velocidad

• De ángulo fijo
• Cubo basculante
• Rotores verticales

ULTRACENTRÍFUGAS

1. Es el instrumento más sofisticado.
2. La ultracentrífuga tiene una velocidad máxima de 65.000 RPM (100.000's x g).
3. Se genera un calor intenso debido a la alta velocidad, por lo que las cámaras de hilatura deben estar refrigeradas y mantenerse a un alto vacío.
4. Se utiliza tanto para trabajos preparatorios como para trabajos analíticos.

Tipos de centrifugación

1. Granulación diferencial (centrifugación diferencial)

• Es el tipo de centrifugación más empleado.
• El tejido, como el hígado, se homogeneiza a 32 grados en una solución de sacarosa que contiene tampón.
• A continuación, el homogeneizado se coloca en una centrifugadora y se hace girar con una fuerza centrífuga constante a una temperatura constante.
• Al cabo de un tiempo se forma un sedimento en el fondo de la centrífuga llamado pellet y una solución superpuesta llamada sobrenadante.
• La solución suprayacente se coloca en otro tubo de centrífuga que se hace girar a mayor velocidad en pasos progresivos.

2. Centrifugación en gradiente de densidad

• Este tipo de centrifugación se utiliza principalmente para purificar virus, ribosomas, membranas, etc.
• Se crea un gradiente de densidad de sacarosa superponiendo suavemente concentraciones más bajas de sacarosa sobre concentraciones más altas en tubos de centrífuga
• Las partículas de interés se colocan sobre el gradiente y se centrifugan en ultracentrífugas.
• Las partículas se desplazan por el gradiente hasta que alcanzan un punto en el que su densidad coincide con la de la sacarosa circundante.
• La fracción se retira y se analiza.

3. Centrifugación por densidad-radiente

• La centrifugación zonal también se conoce como centrifugación en banda o en gradiente
• Se basa en el concepto de coeficiente de sedimentación (es decir, el movimiento del sedimento a través del medio líquido)
• En esta técnica, se crea un gradiente de densidad en un tubo de ensayo con sacarosa y alta densidad en el fondo.
• La muestra de proteína se coloca en la parte superior del gradiente y luego se centrifuga.
• Con la centrifugación, las partículas de sedimentación más rápida de la muestra se adelantan a las más lentas, es decir, la muestra se separa en forma de zonas en el gradiente.
• Las proteínas sedimentan según su coeficiente de sedimentación y las fracciones se recogen creando un agujero en el fondo del tubo.

4. Centrifugación isopínica

• La muestra se carga en el tubo con la solución formadora de gradiente (encima o debajo del gradiente preformado, o mezclada con el gradiente autoformado)
• La solución de la muestra biológica y la sal de cesio se distribuye uniformemente en un tubo de centrífuga y se hace girar en una ultracentrífuga.
• Bajo la influencia de la fuerza centrífuga, las sales de cesio se redistribuyen para formar un gradiente de densidad de arriba a abajo.
• Las partículas se desplazan al punto en el que su densidad de flotación es igual a esa parte del gradiente y forman bandas. Es decir, las moléculas de la muestra se desplazan a la región donde su densidad es igual a la del gradiente.
• Es un procedimiento de equilibrio "verdadero", ya que depende de las densidades de flotación, no de las velocidades

Por ejemplo: gradientes de CsCl, NaI para macromoléculas y nucleótidos - gradientes "autoformados" bajo fuerza centrífuga.

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Aplicaciones de la centrifugación

• Para separar dos sustancias miscibles
• Para analizar las propiedades hidrodinámicas de las macromoléculas
• Purificación de células de mamífero
• Fraccionamiento de orgánulos subcelulares (incluyendo membranas/fracciones de membrana) Fraccionamiento de vesículas de membrana
• Separación del polvo de tiza del agua
• Eliminación de la grasa de la leche para producir leche desnatada
• Separación de partículas de un flujo de aire mediante separación ciclónica
• La clarificación y estabilización del vino
• Separación de los componentes de la orina y de la sangre en los laboratorios forenses y de investigación
• Ayuda a la separación de proteínas mediante técnicas de purificación como la salazón, por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio.

Referencias

1. http://trishul.sci.gu.edu.au/courses/7204BPS/Centrifugation_Lecture_2008.pdf
2. http://www.biologydiscussion.com/biochemistry/centrifugation/centrifuge-introduction-types-uses-and-other-details-with-diagram/12489
3. https://www.slideshare.net/poojakamble1609/principles-and-applications-of-centrifugation
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Centrifugation
5. https://www.slideshare.net/khadeejaikram56/centrifugation-49732927

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