HPLC- Definición, Principio, Partes, Tipos, Usos, Diagrama

¿Qué es la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)?

Cromatografía líquida de alto rendimiento cromatografía líquida o comúnmente conocida como HPLC, es una técnica analítica utilizada para separar, identificar o cuantificar cada componente de una mezcla.

La mezcla se separa utilizando el principio básico de la columna cromatografía y luego se identifican y cuantifican por espectroscopia.

En la década de 1960, la cromatografía en columna LC, con sus columnas de vidrio adaptadas a baja presión, se convirtió en la HPLC, con sus columnas metálicas adaptadas a alta presión.

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Así pues, la HPLC es básicamente una forma muy mejorada de la cromatografía líquida en columna. En lugar de dejar que el disolvente gotee a través de una columna por gravedad, se fuerza su paso a altas presiones de hasta 400 atmósferas.

Fuente de la imagen: Sartorius AG.

Principio de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

• La purificación tiene lugar en una columna de separación entre una fase estacionaria y una fase móvil.
• La fase estacionaria es un material granular con partículas porosas muy pequeñas en una columna de separación.
• La fase móvil, por su parte, es un disolvente o una mezcla de disolventes que se hace pasar a alta presión por la columna de separación.
• A través de una válvula con un bucle de muestra conectado, es decir, un pequeño tubo o un capilar de acero inoxidable, la muestra se inyecta en el flujo de la fase móvil desde la bomba hasta la columna de separación mediante una jeringa.
• Posteriormente, los componentes individuales de la muestra migran a través de la columna a diferentes velocidades porque son retenidos en distinto grado por las interacciones con la fase estacionaria.
• Después de salir de la columna, las sustancias individuales se detectan mediante un detector adecuado y se transmiten como señal al software de HPLC del ordenador.
• Al final de esta operación/ejecución, se obtiene un cromatograma en el software de HPLC del ordenador.
• El cromatograma permite identificar y cuantificar las diferentes sustancias.

Instrumentación de Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

Fuente de la imagen: LaboratoryInfo.

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La bomba

• El desarrollo de la HPLC condujo al desarrollo del sistema de bombas.
• La bomba se coloca en la corriente más alta del sistema de cromatografía líquida y genera un flujo de eluyente desde el depósito de disolvente hacia el sistema.
• La generación de alta presión es un requisito "estándar" de las bombas, además de que debe ser capaz de proporcionar una presión constante en cualquier condición y un caudal controlable y reproducible.
• La mayoría de las bombas utilizadas en los sistemas actuales de LC generan el caudal mediante el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor (bombas recíprocas). Este movimiento del pistón produce "pulsos".

Inyector

• Se coloca un inyector junto a la bomba.
• El método más sencillo es utilizar una jeringa, y la muestra se introduce en el flujo de eluyente.
• El método de inyección más utilizado se basa en bucles de muestreo.
• También está muy extendido el uso del sistema de automuestreador (autoinyector) que permite realizar inyecciones repetidas en un tiempo programado.

Columna

Cromatografía - Definición, Principio, Tipos, Aplicaciones

• La separación se realiza dentro de la columna.
• Las columnas recientes se preparan a menudo en una carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio.
• El material de empaquetamiento que se utiliza generalmente es la sílice o los geles poliméricos frente al carbonato cálcico.
  El eluyente utilizado para la LC varía entre disolventes ácidos y básicos.
• La mayoría de los alojamientos de las columnas son de acero inoxidable, ya que este material tolera una gran variedad de disolventes.

Detector

• La separación de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que para observar la separación obtenida se utiliza un detector.
• La composición del eluyente es constante cuando no hay analito. Mientras que la presencia del analito cambia la composición del eluyente. Lo que hace el detector es medir estas diferencias.
• Esta diferencia se controla en forma de señal electrónica. Existen diferentes tipos de detectores.

Grabador

• El cambio en el eluyente detectado por un detector tiene la forma de una señal electrónica, por lo que todavía no es visible para nuestros ojos.
• Antiguamente, se utilizaba popularmente el registrador de datos con bolígrafo (papel). Hoy en día, es más común el uso de un procesador de datos (integrador) basado en un ordenador.
• Hay varios tipos de procesadores de datos; desde un sistema sencillo que consiste en la impresora y el procesador de textos incorporados, hasta los que tienen un software diseñado específicamente para un sistema de LC que no sólo adquiere datos, sino que tiene funciones como el ajuste de picos, la corrección de la línea de base, el cálculo automático de la concentración, la determinación del peso molecular, etc.

Desgasificador

El eluyente utilizado para el análisis de LC puede contener gases, como el oxígeno, que no son visibles para nuestros ojos.

• Cuando hay gas en el eluyente, éste se detecta como ruido y provoca una línea de base inestable.
• El desgasificador utiliza un tubo de membrana polimérica especial para eliminar los gases.
• Los numerosos y pequeñísimos poros de la superficie del tubo de polímero permiten el paso del aire e impiden el paso de cualquier líquido.

Calentador de columna

La temperatura de la columna suele influir en gran medida en la separación en CL.

• Para obtener resultados repetibles, es importante mantener unas condiciones de temperatura constantes.
• También para algunos análisis, como el del azúcar y el ácido orgánico, se pueden obtener mejores resoluciones a temperaturas elevadas (de 50 a 80°C).
• Así, las columnas se mantienen generalmente dentro del horno de columnas (calentador de columnas).

Tipos de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

1. Fase normal:

El relleno de la columna es polar (por ejemplo, sílice) y la fase móvil es apolar. Se utiliza para compuestos sensibles al agua, isómeros geométricos, isómeros cis-trans y compuestos quirales.

2. Fase inversa:

El relleno de la columna es no polar (por ejemplo, C18), la fase móvil es agua + disolvente miscible (por ejemplo, metanol). Puede utilizarse para muestras polares, no polares, ionizables e iónicas.

3. Intercambio iónico:

El relleno de la columna contiene grupos iónicos y la fase móvil es un tampón. Se utiliza para separar aniones y cationes.

4. Exclusión por tamaño:

Las moléculas se difunden en los poros de un medio poroso y se separan según su tamaño relativo con respecto al tamaño del poro. Las moléculas grandes eluyen primero y las más pequeñas después.

Aplicaciones de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

La HPLC se ha convertido en un método de aplicación universal, por lo que se utiliza en casi todas las áreas de la química, la bioquímica y la farmacia.

• Análisis de medicamentos
• Análisis de polímeros sintéticos
• Análisis de contaminantes en la analítica medioambiental
• Determinación de fármacos en matrices biológicas
• Aislamiento de productos valiosos
• Pureza de los productos y control de calidad de los productos industriales y de la química fina
• Separación y purificación de biopolímeros, como enzimas o ácidos nucleicos
• Purificación del agua
• Preconcentración de componentes traza
• Cromatografía de intercambio de ligandos
• Cromatografía de intercambio iónico de proteínas
• Cromatografía de intercambio aniónico de hidratos de carbono y oligosacáridos de alto pH

Ventajas de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

1. Velocidad
2. Eficiencia
3. Precisión
4. Versátil y extremadamente preciso a la hora de identificar y cuantificar los componentes químicos.

Limitaciones

1. Coste: A pesar de sus ventajas, la HPLC puede ser costosa, ya que requiere grandes cantidades de sustancias orgánicas caras.
2. Complejidad
3. La HPLC tiene baja sensibilidad para determinados compuestos, y algunos no pueden detectarse porque se adsorben de forma irreversible.
4. Las sustancias volátiles se separan mejor por cromatografía de gases.

Referencias

1. https://www.shodex.com/en/kouza/a.html
2. https://www.alphacrom.com/en/hplc-basics
3. https://laboratoryinfo.com/hplc/
4. https://sciencing.com/disadvantages-advantages-hplc-5911530.html
5. https://www.slideshare.net/krakeshguptha/hplc-26970638
6. https://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html
7. https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=8468
8. https://www.ru.ac.za/media/rhodesuniversity/content/nanotechnology/documents/chromatography%20Augustus.pdf