Electroforesis en gel de agarosa - Definición, principio, partes, pasos, aplicaciones

¿Qué es la electroforesis en gel de agarosa?

• La electroforesis en gel de agarosa es un método de electroforesis en gel que se utiliza en bioquímica, biología molecular, genética y química clínica para separar una población mixta de macromoléculas como el ADN , el ARN o las proteínas en una matriz de agarosa.
• La agarosa es un polímero lineal natural extraído de las algas marinas que forma una matriz de gel por enlace de hidrógeno cuando se calienta en un tampón y se deja enfriar.
• Son el medio más popular para la separación de ácidos nucleicos de tamaño moderado y grande y tienen un amplio rango de separación.

Principio de la electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel separa los fragmentos de ADN por su tamaño en un medio de soporte sólido, como un gel de agarosa. La muestra (ADN) se pipetea en los pocillos de la muestra, seguida de la aplicación de una corriente eléctrica que hace que el ADN cargado negativamente migre (electroforesis) hacia el extremo anodal, positivo (+ve). La velocidad de migración es proporcional al tamaño: los fragmentos más pequeños se mueven más rápidamente y acaban en el fondo del gel.

El ADN se visualiza incluyendo en el gel un colorante intercalado, el bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN absorben el colorante al migrar por el gel. La iluminación con luz ultravioleta hace que el colorante intercalado sea fluorescente.

Los fragmentos más grandes presentan una fluorescencia más intensa. Aunque cada uno de los fragmentos de una misma clase de molécula está presente en proporciones equimolares, los fragmentos más pequeños incluyen menos masa de ADN, absorben menos tinte y, por tanto, presentan una fluorescencia menos intensa. Se puede ejecutar simultáneamente un conjunto "escalera" de fragmentos de ADN de tamaño conocido y utilizarlo para estimar los tamaños de los demás fragmentos desconocidos.

Requisitos/ Instrumentación de la electroforesis en gel de agarosa

El equipo y los suministros necesarios para llevar a cabo la electroforesis en gel de agarosa son relativamente sencillos e incluyen

1. Un cámara de electroforesis y fuente de alimentación
2. Bandejas de fundición de gelque están disponibles en varios tamaños y están compuestas de plástico transparente a los rayos UV. Los extremos abiertos de las bandejas se cierran con cinta adhesiva mientras se vierte el gel, y luego se retiran antes de la electroforesis.
3. Peines para muestrasalrededor de los cuales se vierte el medio fundido para formar pozos de muestra en el gel.
4. Tampón de electroforesis, normalmente Tris-acetato-EDTA (TAE) o Tris-borato-EDTA (TBE).
5. Tampón de cargaque contiene algo denso (por ejemplo, glicerol) para permitir que la muestra "caiga" en los pocillos de la muestra, y uno o dos colorantes de seguimiento, que migran en el gel y permiten controlar visualmente hasta dónde ha llegado la electroforesis.
6. Tinción: Las moléculas de ADN se visualizan fácilmente bajo una lámpara ultravioleta cuando se electrifican en presencia del bromuro de etidio extrínseco. Alternativamente, los ácidos nucleicos pueden teñirse después de la separación electroforética sumergiendo el gel en una solución de bromuro de etidio. Cuando se intercala en el ADN de doble cadena, la fluorescencia de esta molécula aumenta mucho. También es posible detectar el ADN con el fluor extrínseco 1-anilino 8-naftaleno sulfonato.
7. Transiluminador (una caja de luz ultravioleta), que se utiliza para visualizar el ADN teñido en los geles.

Pasos de la electroforesis en gel de agarosa

1. Para preparar el gel, se mezcla el polvo de agarosa con el tampón de electroforesis hasta la concentración deseada, y se calienta en un horno microondas para fundirlo.

La concentración del gel de agarosa

• El porcentaje de agarosa utilizado depende del tamaño de los fragmentos a resolver.
• La concentración de agarosa se denomina porcentaje de agarosa en relación con el volumen del tampón (p/v), y los geles de agarosa suelen estar en el rango del 0,2% al 3%.
• Cuanto menor sea la concentración de agarosa, más rápido migrarán los fragmentos de ADN.
• En general, si el objetivo es separar grandes fragmentos de ADN, debe utilizarse una concentración baja de agarosa, y si el objetivo es separar pequeños fragmentos de ADN, se recomienda una concentración alta de agarosa.

2. Se añade bromuro de etidio al gel (concentración final de 0,5 ug/ml) para facilitar la visualización del ADN tras la electroforesis.
3. Tras enfriar la solución a unos 60oC, se vierte en una bandeja de colada que contiene un peine de muestras y se deja solidificar a temperatura ambiente.
4. Una vez solidificado el gel, se retira el peine, teniendo cuidado de no rasgar el fondo de los pocillos.
5. El gel, todavía en la bandeja de plástico, se introduce horizontalmente en la cámara de electroforesis y se cubre con tampón.
6. A continuación, se pipetean las muestras de ADN mezcladas con el tampón de carga en los pocillos de la muestra, se colocan la tapa y los cables de alimentación en el aparato y se aplica una corriente.
7. El flujo de corriente puede confirmarse observando las burbujas que salen de los electrodos.
8. El ADN migrará hacia el electrodo positivo, que suele ser de color rojo, debido a su carga negativa.
9. La distancia a la que ha migrado el ADN en el gel puede juzgarse controlando visualmente la migración de los colorantes de rastreo, como el azul de bromofenol y los colorantes de cianol de xileno.

Electroforesis en gel de agarosa Vídeo de animación

Aplicaciones de la electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel de agarosa es un método utilizado habitualmente para separar proteínas, ADN o ARN.

• Estimación del tamaño de las moléculas de ADN
• Análisis de los productos de la PCR, por ejemplo, en el diagnóstico genético molecular o la huella genética
• Separación del ADN genómico restringido antes del análisis Southern, o del ARN antes del análisis Northern.
• La electroforesis en gel de agarosa se emplea ampliamente para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN tras la digestión con enzimas de restricción, por ejemplo, en el mapeo de restricción del ADN clonado.
• La electroforesis en gel de agarosa se utiliza habitualmente para resolver el ADN circular con diferente topología de superenrollamiento, y para resolver los fragmentos que difieren debido a la síntesis del ADN.
• Además de proporcionar un medio excelente para el análisis del tamaño de los fragmentos, los geles de agarosa permiten la purificación de los fragmentos de ADN. Dado que la purificación de los fragmentos de ADN separados por su tamaño en un gel de agarosa es necesaria para una serie de técnicas moleculares como la clonación, es vital poder purificar los fragmentos de interés del gel.

Ventajas de la electroforesis en gel de agarosa

• Para la mayoría de las aplicaciones, sólo se necesita una agarosa monocomponente y no se requieren catalizadores de polimerización. Por tanto, los geles de agarosa son sencillos y rápidos de preparar.
• El gel se vierte fácilmente y no desnaturaliza las muestras.
• Las muestras también se pueden recuperar.

Desventajas de la electroforesis en gel de agarosa

• Los geles pueden fundirse durante la electroforesis.
• El tampón puede agotarse.
• Las diferentes formas de material genético pueden funcionar de forma imprevisible.

Referencias

1. https://pdfs.semanticscholar.org/36cf/d4ada922c44d233b6ebfa2af2c956c92e4ec.pdf
2. https://www.mun.ca/biology/scarr/Gel_Electrophoresis.html
3. https://www.wou.edu/las/physci/ch462/Gel%20Electrophoresis.pdf
4. https://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
5. https://msu.edu/course/css/451/Lecture/PT-electrophoresis%20(2009).pdf
6. http://library.umac.mo/ebooks/b28050459.pdf