¿Cuál es la diferencia entre los ensayos de PCR tradicionales anidados y en tiempo real?

Que diferencia principal entre ensayos de PCR convencionales anidados y en tiempo real es que la PCR convencional es una técnica desarrollada para amplificar secuencias específicas de ADN y la PCR anidada es una modificación de la PCR convencional que consta de dos reacciones de amplificación secuenciales, mientras que la PCR en tiempo real es una variante de la PCR convencional que es capaz de cuantificar el producto amplificado.

La PCR es una técnica científica ampliamente utilizada en investigación y medicina para detectar ADN. Las pruebas de PCR se utilizan para detectar antígenos mediante la detección de su ADN o ARN. Generalmente, el ARN viral está presente en el cuerpo antes de que se detecten los anticuerpos o aparezcan los síntomas de la enfermedad. Una prueba de PCR puede determinar de manera temprana si alguien tiene el virus o no. Actualmente, la PCR es la prueba estándar para detectar la enfermedad de COVID-19. Existen diferentes tipos de técnicas de PCR, como PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR multiplex, PCR de inicio en caliente y PCR de largo alcance, etc.

CONTENIDO

1. Descripción general y diferencia clave
2. ¿Qué son los ensayos de PCR tradicionales?
3. ¿Qué son los ensayos de PCR anidados?
4. ¿Qué son los ensayos de PCR en tiempo real?
5. Similitudes: ensayos de PCR tradicionales anidados y en tiempo real
6. Ensayos de PCR convencionales, anidados y en tiempo real en formato tabular
7. Resumen: ensayos de PCR convencionales, anidados y en tiempo real

¿Qué son los ensayos de PCR convencionales?

El ensayo de PCR convencional es un in vitro Técnica de amplificación de ADN que se realiza de forma rutinaria en los laboratorios de biología molecular. Este método permitió la producción de miles a millones de copias de un fragmento de ADN dado. Kary Mullis introdujo esta técnica en 1980. Esta técnica requiere un fragmento de ADN conocido como plantilla para hacer muchas copias de él. La polimerasa Taq funciona como una enzima polimerasa de ADN, que cataliza la síntesis de nuevas hebras de la secuencia molde.

Los cebadores en la mezcla de PCR sirven como puntos de partida para las extensiones de fragmentos. Todos los ingredientes necesarios para hacer copias de ADN están incluidos en la mezcla de PCR. La reacción de PCR se realiza en una máquina de PCR y debe alimentarse con la mezcla y el programa de PCR correctos. Si la mezcla de reacción y el programa son correctos, producirá el número requerido de copias de una determinada pieza de ADN a partir de una cantidad muy pequeña de ADN.

Figura 01: Ensayo de PCR convencional

Hay tres pasos principales involucrados en una reacción de PCR: desnaturalización, recocido del cebador y elongación de la cadena. Estos tres pasos tienen lugar a tres temperaturas diferentes. El tampón de PCR mantiene las condiciones óptimas para que funcione la polimerasa Taq. Estos tres pasos de la reacción de PCR se repiten para producir la cantidad requerida de producto de PCR. Con cada reacción de PCR, el número de copias de ADN se duplica. Por lo tanto, se puede observar una amplificación exponencial en la PCR. El producto de la PCR se puede resolver mediante electroforesis en gel, ya que produce una cantidad visible de ADN en un gel y se puede purificar para estudios posteriores, como la secuenciación.

La PCR es una herramienta valiosa en la investigación médica y biológica. Especialmente en los estudios forenses, la PCR tiene un valor inmenso, ya que puede amplificar el ADN para estudios a partir de muestras diminutas de delincuentes y crear perfiles de ADN forense. La PCR se usa ampliamente en muchas áreas de la biología molecular, incluida la genotipificación, la clonación de genes, la detección de mutaciones, la secuenciación de ADN, las micromatrices de ADN y las pruebas de paternidad.

¿Qué son los ensayos de PCR anidados?

La PCR anidada es un tipo de PCR que reduce la amplificación no específica del ADN. Hay dos PCR consecutivas o dos reacciones de amplificación consecutivas en el ensayo de PCR anidado. Se forma un producto de PCR durante la primera reacción de amplificación. Después de la primera reacción, se realiza una segunda reacción de amplificación utilizando el producto de PCR de la primera reacción. Por lo tanto, los cebadores de la segunda mezcla de reacción se unen y amplifican el primer producto de la PCR.

Figura 02: PCR anidado

Los pares de cebadores son diferentes en cada reacción. La unión no específica de los cebadores se reduce en la PCR anidada. Los ensayos de PCR anidados son útiles para aumentar la sensibilidad y/o la especificidad. Sin embargo, la PCR anidada requiere el conocimiento de la secuencia de interés.

¿Qué son los ensayos de PCR en tiempo real?

La PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (Q-PCR) es una versión modificada de la PCR que mide cuantitativamente los productos de la PCR. Por lo tanto, esta técnica cuantifica la amplificación en tiempo real utilizando una máquina de PCR en tiempo real. También es un método útil para determinar la cantidad de una secuencia diana o gen presente en una muestra.

La característica interesante de la PCR en tiempo real es que combina la amplificación y la cuantificación real en un solo paso. Por lo tanto, se puede eliminar la necesidad de electroforesis en gel para la detección mediante la técnica de PCR en tiempo real. Finalmente, el uso de colorantes fluorescentes para marcar los productos de PCR durante las reacciones de PCR conducirá a la cuantificación directa. A medida que se acumulan los productos de la PCR, las señales de fluorescencia también se acumulan y la máquina en tiempo real las mide. SYBR Green y Taqman son dos métodos para detectar u observar el proceso de amplificación por PCR en tiempo real. Ambos métodos monitorean el progreso del proceso de amplificación e informan la cantidad de producto en tiempo real.

Figura 03: PCR en tiempo real

La PCR en tiempo real tiene una variedad de aplicaciones, como la cuantificación de la expresión génica, el análisis de microARN y ARN no codificante, el genotipado de SNP, la detección de variantes del número de copias, la detección de mutaciones raras, la detección de organismos modificados genéticamente y la detección de agentes infecciosos.

¿Cuáles son las similitudes entre los ensayos de PCR convencionales anidados y en tiempo real?

• Los ensayos de PCR anidados y en tiempo real son modificaciones del ensayo de PCR tradicional.
• Las tres técnicas amplifican muestras de ADN.
• Sus productos se pueden utilizar en secuenciación o análisis.
• Estos ensayos requieren cebadores.

¿Cuál es la diferencia entre los ensayos de PCR en tiempo real y anidados convencionales?

La PCR convencional es una técnica desarrollada para amplificar secuencias específicas de ADN. Por su parte, la PCR anidada es una modificación de la PCR tradicional, que consiste en dos reacciones de amplificación consecutivas, y la PCR en tiempo real es una variante de la PCR tradicional, capaz de cuantificar el producto amplificado. Entonces, esta es la diferencia clave entre los ensayos de PCR anidados tradicionales y en tiempo real. A diferencia de la PCR convencional y en tiempo real, la PCR anidada utiliza dos conjuntos de cebadores. Además, en la PCR anidada existen dos reacciones de amplificación secuencial para reducir la amplificación no específica. además, los ensayos de PCR convencionales y en tiempo real no implican dos reacciones de amplificación consecutivas.

La siguiente infografía enumera las diferencias entre los ensayos de PCR tradicionales anidados y en tiempo real en forma tabular para una comparación en paralelo.

Resumen: ensayos de PCR convencionales, anidados y en tiempo real

La PCR convencional es la primera técnica desarrollada para amplificar fragmentos de ADN específicos. La PCR anidada y la PCR en tiempo real son dos variantes de la PCR convencional. Hay dos reacciones de amplificación secuencial y el uso de dos conjuntos de cebadores en la PCR anidada. La PCR en tiempo real se desarrolla para cuantificar el producto de PCR amplificado. Por lo tanto, esto resume la diferencia entre los ensayos de PCR tradicionales anidados y en tiempo real.

Relación:

1. Green MR, Sambrook J. "Reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR)". Registros de Cold Spring Harbor, Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU.
2. "Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real". Una visión general | Temas de ScienceDirect.

Imagen de cortesía:

1. "Reacción en cadena de la polimerasa" por Enzoklop - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
2. "PCR anidado" de Zephyris en la Wikipedia en inglés (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia
3. "PCR en tiempo real" por Informatic - Trabajo propio (CC BY-SA 3.0) a través de Commons Wikimedia