Cromatografía en columna - Definición, principio, partes, pasos, usos

Cromatografía es una importante técnica biofísica que permite la separación, identificación y purificación de los componentes de una mezcla para su análisis cualitativo y cuantitativo.

La cromatografía es una técnica de separación en la que se hace que una fase móvil que lleva una mezcla se mueva en contacto con una fase estacionaria selectivamente absorbente.

Existen varios tipos de cromatografía, que se diferencian por la fase móvil y la fase estacionaria utilizadas.

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¿Qué es la cromatografía en columna?

La cromatografía en columna es una técnica en la que las sustancias que hay que separar se introducen en la parte superior de una columna rellena con un adsorbente, se hacen pasar por la columna a diferentes velocidades que dependen de la afinidad de cada sustancia por el adsorbente y por el disolvente o la mezcla de disolventes, y se suelen recoger en solución al salir de la columna en diferentes momentos.

Se trata de un sólido-líquido técnica en la que la fase estacionaria es un sólido & la la fase móvil es un líquido o un gas.

Fue desarrollada por el químico estadounidense D.T Day en 1900, mientras que M.S. Tswett, botánico polaco, utilizó en 1906 columnas de adsorción en sus investigaciones sobre los pigmentos de las plantas.

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Fuente de la imagen: PrepGenie.

Formas de Cromatografía en Columna

Hay dos formas de cromatografía en columna.

1. Cromatografía líquida (CL)
2. Cromatografía de gases (GC)

Las formas de cromatografía en columna más utilizadas son:

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• Cromatografía de adsorción
• Cromatografía de partición
• Cromatografía de intercambio iónico
• Cromatografía en gel

Principio de la cromatografía en columna

• En la cromatografía en columna, la fase estacionaria se introduce en una columna de vidrio o de metal.
• A continuación, se aplica la mezcla de analitos y se hace pasar la fase móvil, comúnmente denominada eluyente, a través de la columna mediante un sistema de bombeo o aplicando presión de gas.
• La fase estacionaria se recubre en pequeñas partículas discretas (la matriz) y se introduce en la columna o se aplica como una fina película en la pared interior de la columna.
• A medida que el eluyente fluye a través de la columna, los analitos se separan en función de sus coeficientes de distribución y emergen individualmente en el eluyente al salir de la columna.

Instrumentación de la cromatografía en columna

Un sistema típico de cromatografía en columna que utiliza una fase móvil gaseosa o líquida consta de los siguientes componentes

Una fase estacionaria:

• Elegido para que sea apropiado para los analitos que se van a separar.

Una columna:

• En la cromatografía de líquidos, suelen tener una longitud de 25 a 50 cm y un diámetro interior de 4 mm, y son de acero inoxidable, mientras que en la cromatografía de gases tienen una longitud de 1 a 3 m y un diámetro interior de 2 a 4 mm, y son de vidrio o de acero inoxidable.
• Pueden ser del tipo convencional rellenadas con la fase estacionaria, o del tipo microperforado en el que la fase estacionaria está recubierta directamente en la pared interior de la columna.

Una fase móvil y un sistema de suministro:

• Elegido para complementar la fase estacionaria y, por tanto, para discriminar los analitos de la muestra y para suministrar un caudal constante a la columna.

Un sistema inyector:

• Para hacer llegar las muestras de ensayo a la parte superior de la columna de forma reproducible.

Un detector y un registrador gráfico:

• Para dar un registro continuo de la presencia de los analitos en el eluido a medida que sale de la columna.
• La detección suele basarse en la medición de un parámetro físico, como la absorción visible o ultravioleta o la fluorescencia.
• Un pico en el registrador gráfico representa cada analito separado.

Un colector de fracciones: Para recoger los analitos separados para posteriores estudios bioquímicos.

Pasos de la cromatografía en columna

A. Preparación de la columna

• La columna consiste principalmente en un tubo de vidrio relleno de una fase estacionaria adecuada.
• En el fondo de la columna se coloca una lana de vidrio/algodón o una almohadilla de amianto antes de introducir la fase estacionaria.
• Tras el empaquetado, se mantiene un disco de papel en la parte superior, para que la capa estacionaria no se altere durante la introducción de la muestra o la fase móvil.

Hay dos tipos de preparación de la columna, que son

1. Envasado en seco / llenado en seco

En este caso, la cantidad necesaria de adsorbente se vierte como polvo fino y seco en la columna y se deja que el disolvente fluya a través de la columna hasta que se alcance el equilibrio.

2. Empaquetado húmedo / llenado húmedo

En este caso, se prepara la lechada de adsorbente con la fase móvil y se vierte en la columna. Se considera la técnica ideal para el empaquetado.

• Antes de utilizar la columna, hay que lavarla adecuadamente y secarla.
• La columna también debe estar libre de impurezas y llenarse uniformemente con la fase estacionaria.

B. Introducción de la muestra

• La muestra, que suele ser una mezcla de componentes, se disuelve en una cantidad mínima de la fase móvil.
• Toda la muestra se introduce en la columna de una vez y se adsorbe en la parte superior de la columna.
• A partir de esta zona, la muestra individual puede separarse mediante un proceso de elución.

C. Elución

• Mediante la técnica de elución, los componentes individuales se separan de la columna.
• Se puede conseguir mediante dos técnicas:
• Técnica de elución isocrática: Se utiliza la misma composición de disolvente o un disolvente de la misma polaridad durante todo el proceso de separación.

Por ejemplo, el uso de cloroformo solo.

• Técnica de elución en gradiente: Se utilizan disolventes de polaridad gradual ↑ o fuerza de elución ↑ durante el proceso de separación.

Por ejemplo, inicialmente benceno, luego cloroformo, luego acetato de etilo y luego cloroformo

D. Detección de los componentes

• Si los compuestos separados en un procedimiento de cromatografía en columna están coloreados, el progreso de la separación puede controlarse simplemente de forma visual.
• Si los compuestos a aislar en la cromatografía en columna son incoloros
• En este caso, se recogen secuencialmente pequeñas fracciones del eluyente en tubos etiquetados y se analiza la composición de cada fracción por TLC.

Factores que afectan a la eficacia de la columna

• Dimensiones de la columna
• Tamaño de las partículas del adsorbente
• Naturaleza del disolvente
• Temperatura de la columna
• Presión

Aplicaciones

La cromatografía en columna es uno de los métodos más útiles para la separación y purificación de sólidos y líquidos. Su principal aplicación es:

• Separación de mezclas de compuestos.
• Eliminación de impurezas o proceso de purificación.
• Aislamiento de los componentes activos.
• Aislamiento de metabolitos de fluidos biológicos.
• Estimación de fármacos en formulación o extractos crudos.

Ventajas

• Cualquier tipo de mezcla puede separarse mediante cromatografía en columna.
• También se puede separar cualquier cantidad de la mezcla.
• Mayor elección de la fase móvil.
• En el tipo preparatorio, la muestra puede separarse y reutilizarse.
• Es posible la automatización.

Limitaciones

• Método que requiere mucho tiempo.
• Se necesitan más cantidades de disolventes que pueden ser caros.
• La automatización hace que la técnica sea más complicada y costosa.

Referencias

1. Wilson, K., Walker, J. (2018). Principios y Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular (8 eds.). Cambridge University Press: Nueva York.
2. https://www.slideshare.net/shaisejacob/column-chromato
3. https://chromatography.conferenceseries.com/events-list/applications-of-chromatography
4. https://www.slideshare.net/RameshJupudi/column-chromatography-ppt
5. http://library.umac.mo/ebooks/b28050630.pdf
6. https://www.slideshare.net/krakeshguptha/column-chromatography-26966949
7. https://en.wikipedia.org/wiki/Column_chromatography
8. https://www.merriam-webster.com/medical/column%20chromatography