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¿Qué es un microscopio confocal?
- El concepto de microscopía confocal fue desarrollado por primera vez por Marvin Minsky en la década de 1950, en la Universidad de Harvard con el objetivo de visualizar la red neuronal sin teñir los tejidos, pero no ha dado sus frutos debido a la falta de una fuente de luz suficiente y un sistema computarizado para almacenar grandes datos.
- El trabajo fue posteriormente adaptado por David Egger M. y Mojmir Petran, formando un microscopio confocal de rayos múltiples a fines de la década de 1960. usaron un disco giratorio conocido como Nipkow que usaron para examinar tejidos cerebrales y células ganglionares que no estaban teñidas. La técnica fue posteriormente modificada y publicada por Egger formando un microscopio láser confocal de barrido mecánico, capaz de visualizar imágenes de células.
- Los desarrollos posteriores en la ciencia, incluido el desarrollo de tecnología informática y láser y la manipulación de imágenes digitales mediante algoritmos, han mejorado los avances en microscopía confocal, formando microscopios confocales prácticamente utilizables por varios científicos, incluidos G. Fred Brakenhoff (1979), Colin Sheppard, Tony Wilson, Brad Amos y John White (década de 1980).
- El primer microscopio confocal comercial se desarrolló en 1987 con óptica y electrónica mejoradas, láseres potentes con alta eficiencia de escaneo.
- El microscopio confocal moderno tiene toda la integración posible de tecnología y componentes mecánicos, incluidos los componentes ópticos, que realizan la función principal de la configuración mediante el uso de detectores electrónicos, una computadora y sistemas láser.
- El funcionamiento del microscopio confocal es una función colectiva de todos sus componentes para producir una imagen electrónica. Hasta la fecha, estos microscopios se han utilizado para estudiar moléculas, células microbianas y tejidos.
El precio de un microscopio confocal va desde USD $ 500.000 hasta USD $ 1.000.000.
Figura: Microscopio confocal Zeiss. Fuente de la imagen: ZEISS
Principio del microscopio confocal
- Normalmente, un microscopio convencional (de campo amplio) utiliza diferentes longitudes de onda de una fuente de luz, para ver e iluminar una gran área de una muestra, formando imágenes borrosas, oscuras y abarrotadas, debido a que las imágenes de la muestra celular se capturan desde todas las direcciones. sin un punto focal.
- Para evitar estos problemas, se utiliza un microscopio confocal. En los microscopios de campo amplio o fluorescentes, toda la muestra recibe luz, recibiendo excitación completa y emitiendo luz que es detectada por un fotodetector en el microscopio. Sin embargo, con el microscopio confocal, la iluminación puntual es el principal mecanismo operativo.
- Se examina una muestra teñida con fluorocromo. Cuando un haz de luz se enfoca en un punto particular de la muestra de tinte, produce una iluminación que es enfocada por la lente del objetivo en un plano por encima de los objetivos. La lente tiene una apertura de plano focal ubicada encima de ella, que funciona principalmente para evitar que la luz parásita llegue a la muestra.
- La medición de un punto de iluminación tiene un diámetro entre 0,25 y 0,8 µm, determinado por la apertura numérica de la lente, y una profundidad entre 0,5 y 1,5 µm, con la intensidad más brillante.
- La muestra normalmente se encuentra entre la lente de la cámara y el punto de enfoque perfecto, conocido como el plano de enfoque Usando el láser del microscopio, el láser escanea un plano de la muestra (escaneando el haz 0 o moviendo la platina (escaneado de platina). Un detector medirá la iluminación y producirá una imagen de la sección óptica. Se recopilan en un monitor computarizado. sistema como datos, formando una imagen 3D que se puede medir y cuantificar.
- Su resultado también se ve favorecido por la apertura situada encima de la lente que bloquea la luz dispersa.
- Las imágenes producidas por el microscopio confocal tienen una excelente capacidad de contracción y resolución a pesar del grosor de la muestra. Las imágenes se almacenan en la imagen 3D de alta resolución de los complejos celulares, incluidas sus estructuras.
- La característica principal del microscopio confocal es que solo detecta lo que está enfocado y todo lo que está fuera del punto de enfoque aparece negro.
La imagen de muestra se forma cuando el escáner del microscopio escanea el haz enfocado a través de un área seleccionada con el control de dos espejos oscilantes de alta velocidad. Su movimiento es facilitado por motores galvanométricos. Un espejo mueve el haz de izquierda a derecha en el lado eje x mientras que el segundo espejo traslada el rayo a lo largo del eje Y Después de un escaneo en el eje X, el haz regresa rápidamente a su punto de partida para iniciar un nuevo escaneo, un proceso conocido como flyback. No se recopila información durante el proceso de retorno, por lo que el punto de enfoque, que es el área de interés, es lo que ilumina el escáner láser.
Partes del microscopio confocal
El microscopio de barrido láser confocal consta de unos pocos componentes:
- Objetivo
- Piano fuera de foco
- Plan en foco
- Separadores de haz
- Detector
- Agujero confocal (apertura)
- Láser
- Espejos oscilantes
Tipos de microscopio confocal
- microscopio de barrido láser confocal - Utiliza varios espejos que escanean a lo largo de los ejes X e Y de la muestra, escaneando y escaneando, y la imagen pasa a través de un orificio en el detector.
- disco giratorio, También conocido como disco de Nipkow, es un tipo de microscopio confocal que utiliza varias aberturas móviles (agujeros) en un disco para buscar puntos de luz de forma paralela en un plano específico, durante un largo período. Cuanto mayor sea el tiempo, menor será la energía de excitación necesaria para la iluminación, en comparación con el microscopio de barrido láser confocal. La energía de excitación reducida reduce la fototoxicidad y el fotoblanqueamiento, por lo que se utiliza principalmente para obtener imágenes de células vivas.
- Doble disco giratorio o Microscopio confocal mejorado con microlente -, fue inventado por Yokogawa Electric; funciona de manera similar al disco giratorio, la única diferencia es que tiene un segundo disco giratorio con microlentes que se encuentra antes del disco giratorio que contiene los agujeros. Las microlentes capturan la banda ancha de luz enfocándola en cada orificio, lo que aumenta la cantidad de luz que se dirige a cada orificio y reduce la cantidad de luz que bloquea el disco giratorio. Estos microscopios confocales con microlentes mejoradas son mucho más sensibles que los discos giratorios.
- Microscopio de matriz programable (PAM) - este tipo de microscopio confocal utiliza un modulador de luz espacial (SLM, un objeto que impone alguna forma de modulación espacialmente variable en un haz de luz). El SLM tiene una serie de aperturas móviles (agujeros), con conjuntos de píxeles de opacidad, reflectividad o rotación óptica. El SLM también cuenta con espejos microelectroquímicos que capturan la imagen de una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD).
Cada uno de los microscopios confocales tiene sus ventajas y desventajas, pero todos capturan imágenes grabando imágenes y en ocasiones pueden programarse para obtener imágenes de alta densidad, especialmente el microscopio matricial programado y el microscopio confocal de disco giratorio.
Aplicaciones del microscopio confocal
El microscopio confocal se utiliza en una amplia gama de campos, incluidas las ciencias biomédicas, la biología celular, la genética, la microbiología, la biología del desarrollo, la espectroscopia, la nanociencia (nanoimágenes) y la óptica cuántica.
- En ciencias biomédicas se utiliza en el análisis de infecciones corneales del ojo, cuantificando y analizando cualitativamente las células endoteliales de la córnea.
- Se utiliza para identificar la presencia de elementos fúngicos en el estroma corneal, durante la infección por queratomicosis o para un diagnóstico rápido y una respuesta terapéutica rápida.
- Se utiliza en las industrias farmacéuticas, para asegurar el mantenimiento de productos farmacéuticos de película delgada, permitiendo el control de la calidad y uniformidad de la distribución de medicamentos.
- Se utiliza para recuperar datos de algunos sistemas de almacenamiento óptico 3D. Esto ayudó a cuantificar la edad del papiro de Magdalena.
Beneficios
- La ventaja del microscopio confocal es que mejora la representación de la imagen porque analiza la imagen de un punto óptico a otro, por lo que no hay interferencia con la luz dispersada desde otras partes de la muestra.
- Tienen mejor resolución y cada punto de interés se muestra y captura.
- Se puede utilizar para estudiar tanto células vivas como fijas.
- Se puede utilizar para recopilar secciones ópticas en serie.
- Ilumina uniformemente a través de los puntos de enfoque.
- Ajustan su aumento electrónicamente, sin cambiar las lentes, mediante un factor conocido como factor de zoom.
- Genere conjuntos de imágenes en 3D.
Limitaciones
- Tienen un número limitado de longitudes de onda de excitación, con bandas muy estrechas.
- Los rayos ultravioleta utilizados por los microscopios confocales son caros de producir.
- También son caros de fabricar y comprar.
Referencias y fuentes
- https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/confocal/confocalintro/
- https://www.britannica.com/technology/microscope/Confocal-microscopes
- https://ibidi.com/content/216-confocal-microscopy
- https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/confocal/
- https://en.wikipedia.org/wiki/Spatial_light_modulator
- https://en.wikipedia.org/wiki/Microscopía_confocal
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