Dado que el pH de la fase móvil/tampón/muestra se considera como un parámetro en RP-HPLC, no solo se deben tener en cuenta sus efectos sobre el tiempo de retención, sino también la variación de la asimetría y la eficiencia del cromatógrafo. La fase estacionaria (columna) se ve afectada por el pH. A un pH muy básico, es decir por debajo de un pH de 02,00, la fase estacionaria injertada se liberará del soporte de sílice. La sílice a un pH alto, es decir, por encima de un pH de 08,00, se dañará por autodisolución.
La separación de moléculas básicas a pH bajo a menudo se recomienda en RP-HPLC porque generalmente da como resultado una forma de pico simétrica y una máxima eficiencia de la columna. Sin embargo, el análisis a pH bajo (por debajo de pH-3) no es posible debido a la inestabilidad de los solutos o a problemas de separación de bandas. En tales casos, el pH entre 04,00 y 08,00 o superior se utiliza para separar. Aunque trabajar a un pH intermedio puede generar un espaciado de banda útil para las moléculas ionizables, pueden surgir dificultades en la retención y la reproducibilidad del tamaño de la banda debido a la ionización parcial de las moléculas base.
