Selección de fase móvil en HPLC

La fase móvil es el parámetro más importante en HPLC y en todo tipo de análisis cromatográfico. El tipo de fase móvil utilizada puede tener un gran impacto en la separación y el tiempo de retención. Esto puede suprimir o promover la ionización de las moléculas que se analizan. La selección de una fase móvil adecuada es el paso clave en el desarrollo de métodos cromatográficos.

El requisito esencial para la fase móvil es disolver los componentes a las concentraciones adecuadas para detectarla. Existen diferentes tipos de cromatografía líquida de alta resolución y requieren diferentes tipos de requisitos de fase móvil. En el que se fija la fase estacionaria, mientras que la mezcla de muestras lleva la composición de la fase móvil, que puede variar según las necesidades.

La velocidad de las moléculas en la fase móvil se rige por el grado de sus interacciones con la fase estacionaria/fase móvil. Debido a diferencias en factores, como la fuerza de la riqueza de componentes para la fase estacionaria y la solubilidad en la fase móvil, varios compuestos se mueven más rápido que otros, lo que facilita la separación de compuestos dentro de esta mezcla de muestras.La selección de la fase móvil en los modos de separación de HPLC es la siguiente.

1. La cromatografía de fase inversa (RP-HPLC) separa los analitos basándose en interacciones no polares e involucra una fase móvil polar y una fase estacionaria no polar. En el que el compuesto más polar se eluye primero de la columna de HPLC. Por lo general, la fase móvil en RP-HPLC consta de una mezcla de metanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF), propanol y, a veces, agua tamponada (p. ej., tampón de acetato, tampón de fosfato).
2. NP-HPLC utiliza una fase móvil no polar y una fase estacionaria polar para la separación de los componentes polares de la muestra. En la cromatografía de fase normal, la fase móvil generalmente se usa con solventes no polares, por ejemplo, hexano, isooctano y heptano, con solventes ligeramente más polares como isopropanol, cloroformo o acetato de etilo. Si el solvente no polar Monto aumenta en la fase móvil, el tiempo de retención del analito aumentará.
3. La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende de las interacciones iónicas entre moléculas iónicas y polares; por lo tanto, la solución salina acuosa se usa comúnmente como fases móviles. Se pueden añadir al tampón cantidades medias de disolventes orgánicos polares miscibles en agua, como metanol apto para HPLC. La fuerza y la selectividad del solvente se pueden ajustar administrando las concentraciones de tampón, pH y sal. Dans l'IEC, le temps de rétention d'une molécule dépend de l'affinité de divers ions moléculaires et contre-ions pour les sites chargés à la surface de la phase stationnaire et de plusieurs autres paramètres d'une solution contenant la concentration et la fuerza.
4. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza para separar analitos en función de su tamaño molecular; también se reconoce como cromatografía de permeación en gel cuando la fase móvil es un disolvente orgánico. La elección de la fase móvil en el SEC se basa en su capacidad para disolverse y mantener una viscosidad constante a la temperatura de funcionamiento. La elección de la fase móvil depende de su capacidad para disolver las muestras y mantener una viscosidad constante a la temperatura de trabajo. Las fases móviles para la cromatografía de exclusión por tamaño contienen disolventes muy polares, como alcohol, DMSO, acetona y agua, así como sales cuya fuerza iónica se mantiene.