Efecto del pH en las columnas de HPLC

El uso adecuado de las columnas de HPLC es de suma importancia para la vida útil de la columna. Por lo general, las columnas de cromatografía de fase inversa son estables dentro de un rango de pH de 2 a 8. Si se determina un valor de pH, la medición debe realizarse antes de mezclar con solventes orgánicos en medios acuosos. Hoy en día, las columnas de HPLC están disponibles para su uso fuera de este rango de pH. Sin embargo, si el rango de pH de la fase móvil está fuera del rango de pH de 2 a 8, verifique la información del producto del proveedor antes de usar columnas basadas en sílice.

Dado que el pH de la fase móvil/tampón/muestra se considera como un parámetro en RP-HPLC, no solo se deben tener en cuenta sus efectos sobre el tiempo de retención, sino también la variación de la asimetría y la eficiencia del cromatógrafo. La fase estacionaria (columna) se ve afectada por el pH. A un pH muy básico, es decir por debajo de un pH de 02,00, la fase estacionaria injertada se liberará del soporte de sílice. La sílice a un pH alto, es decir, por encima de un pH de 08,00, se dañará por autodisolución.

La separación de moléculas básicas a pH bajo a menudo se recomienda en RP-HPLC porque generalmente da como resultado una forma de pico simétrica y una máxima eficiencia de la columna. Sin embargo, el análisis a pH bajo (por debajo de pH-3) no es posible debido a la inestabilidad de los solutos o a problemas de separación de bandas. En tales casos, el pH entre 04,00 y 08,00 o superior se utiliza para separar. Aunque trabajar a un pH intermedio puede generar un espaciado de banda útil para las moléculas ionizables, pueden surgir dificultades en la retención y la reproducibilidad del tamaño de la banda debido a la ionización parcial de las moléculas base.