¿Cómo desproteinizar los fluidos biológicos antes del análisis HPLC?

La desproteinización ha contribuido a ampliar el alcance del análisis HPLC de fluidos biológicos. Filtración de muestras antes del análisis HPLC. Se recomienda encarecidamente la importancia de la filtración de muestras en el análisis de cromatografía líquida para prolongar la vida útil de la columna y reducir los costos de mantenimiento, lo que contribuye a aumentar el rendimiento del laboratorio.

Además de la filtración, la desproteinización es necesaria para el análisis de fluidos biológicos como plasma sanguíneo, suero, orina y líquido cefalorraquídeo para determinar los niveles de antibióticos, pesticidas residuales y fármacos psicotrópicos. Las proteínas deben precipitarse y eliminarse de la muestra, de lo contrario, pueden contribuir a la degradación del rendimiento de la columna.

Técnicas de desproteinización

desnaturalización – el calentamiento desnaturaliza la mayoría de las proteínas y, después del calentamiento, las partículas desnaturalizadas se centrifugan y eliminan.

Precipitación Química - más eficiente que el calentamiento, ya que los compuestos sensibles a la temperatura pueden deteriorarse durante el proceso de calentamiento. La acidificación con ácido tricloroacético, la centrifugación y la neutralización con hidróxido de sodio eliminan el 99% de las proteínas. También se puede utilizar ácido percloroacético. Ambos ácidos tienen algunos inconvenientes. El ácido tricloroacético absorbe fuertemente por debajo de 230 nm, mientras que el ácido percloroacético deja sales en solución que pueden precipitar con solventes orgánicos o contribuir al ruido de la base del detector UV

tratamiento con acetonitrilo – El acetonitrilo es un disolvente de uso común que es transparente por debajo de 190 nm. La mezcla y centrifugación de la muestra de plasma y el acetonitrilo dará lugar a la precipitación de aproximadamente el 95 % de las proteínas. Las proteínas no polares como las albúminas permanecen en la fase líquida. El sobrenadante se puede inyectar directamente si se utiliza una columna de espera para eliminar el 5 % restante de las proteínas. Con un uso a largo plazo, la columna protectora debe reemplazarse o invertirse y lavarse para evitar que las proteínas entren en la columna principal.

Desproteinización en línea

En general, es suficiente llevar a cabo la desproteinización fuera de línea, seguida de una centrifugación después de la adición de un ácido o un disolvente orgánico. Sin embargo, para ahorrar tiempo, es deseable la desproteinización en línea automatizada. Varios proveedores de instrumentos ofrecen accesorios especiales que consisten principalmente en una columna de pretratamiento: empaquetada con el recubrimiento de polímero hidrofílico. Las proteínas macromoleculares se conservan mientras que los analitos se dirigen a la columna principal.

Hemos visto que la desproteinización ha ampliado las aplicaciones de las separaciones HPLC de fluidos biológicos, que son matrices complejas, y las estimaciones de HPLC sobre dichos fluidos habrían sido difíciles, si no imposibles, sin usar la técnica.

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