Cuando un compuesto ionizable en una muestra, el pH de la fase móvil o tampón es la variable más significativa en la gestión de la separación y retención en una cromatografía de fase inversa (RP-HPLC). Sin embargo, si no se controla, puede ser el origen de muchos problemas en la separación. Como muchas moléculas analizadas por RP-HPLC tienen uno o varios grupos funcionales ácidos o básicos, principalmente las fases móviles necesitan un control del pH. Ésta es la razón por la que los tampones se utilizan ampliamente en HPLC. Dado que el tiempo de retención de los analitos ionizables es extremadamente sensible al pH de la fase móvil, es necesario controlar el pH mediante la adición de tampón. Cuando se añade una pequeña cantidad de ácido o base, un tampón mantiene el pH.
Es obligatorio conocer el pKa del componente antes de seleccionar el pH tampón. Se recomienda que la forma de pico simétrica del tampón 02 unidades de pH por encima o por debajo del pKa del componente. Si no se conoce la molécula pKa, entonces, probar un pH distinto a la fase móvil podría proporcionar los resultados adecuados. Para toda separación cromatográfica, determinar y ajustar el pH de la fase acuosa, antes de mezclarse con la fase orgánica, para dar los resultados más precisos y reproducibles.
