Cuando desarrolla el método analítico, debe tener en cuenta algunas cosas, como desarrollar un método analítico lo más sencillo posible, no hacerlo complicado, intente utilizar los disolventes de grado HPLC y la fase estacionaria más comunes, desarrolle un método de ahorro de tiempo y costes.
Antes de empezar el desarrollo del método en el instrumento HPLC.
- Utilice siempre disolventes de grado HPLC.
- Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de nylon de 0,45 μ.
- Filtra la muestra a través de un filtro de membrana de nylon de 0,2 μ.
- Sonicar la fase móvil y muestras para eliminar los gases disueltos.
- Purge todo el depósito de disolvente y limpie el muestreo automático para eliminar las burbujas de aire y sustituya los disolventes.
- Establezca el parámetro deseado en el sistema.
- Condicionar la columna con una fase móvil durante el tiempo suficiente.
- Compruebe la presión de la columna, debería ser mínima.
- Empieza el análisis.
- Integrar y conservar los datos
Cómo empezar el desarrollo de métodos en HPLC
- Naturaleza de la muestra (propiedades químicas y físicas de la muestra)
- Número de compuestos presentes
- Estructura del analito
- valor pKa
- solubilidad del analito
- Peso molecular
- Espectro UV (λ máx)
- Selección del método HPLC, condiciones iniciales y optimización.
- HPLC en fase inversa - uso de agua, el disolvente orgánico como fase móvil, columna C18, C8, fenil, TMS y ciano.
Opción principal para la mayoría de muestras, especialmente compuestos neutros y no ionizados solubles en agua y mezclas orgánicas.
- HPLC de pares de iones: uso de agua, el disolvente orgánico como fase móvil, tampón para controlar el pH y como reactivo del par de iones. Columna C18, C8 y Cyano.
Una opción adecuada para los compuestos iónicos/ionizables, especialmente bases/cationes.
- HPLC en fase normal: las fases móviles son como una mezcla de disolventes orgánicos, columnas ciano, diol, amino, sílice.
La siguiente opción mientras la fase inversa y el HPLC de pares de iones no funcionan, opción principal para muestras de lipofílicos que no se solucionan bien en agua y mezclas orgánicas, opción primaria para combinaciones de isómeros.
Aparte de la parte teórica, debería consultar la literatura para observar si ya existen métodos existentes para la misma muestra o una similar. Debe consultar las revistas con libros de referencia para los métodos HPLC. Mientras que el desarrollo del método HPLC sigue las directrices del ICH como el factor de cola, el factor de asimetría, la resolución, el factor de capacidad, el número de placa teórica.
Debería probar con metanol y agua mientras haga el desarrollo del método o, según la solubilidad de su muestra, debería empezar con un 50% y, según la retención del pico, puede cambiar el porcentaje de fase móvil hasta obtener el pico Sharpe, si no se mantiene el pico. en la fase móvil de metanol / acetonitrilo / agua después de esto, puede utilizar tampón. Debe ser fosfato o acetato. El tampón de fosfato ha utilizado habitualmente un tampón por su fácil disponibilidad y su valor PKa. El tampón de fosfato es estable y proporciona el efecto hidrófilo adicional.
Los tampones se utilizan cuando se analiza el analito ionizable con cromatografía de fase inversa y para mantener el pH estable de la fase móvil. Una vez obtenga una mejor forma de pico después de esto, busque la nitidez máxima. Tenga en cuenta que el método debe ser económico y ahorrar tiempo.
La forma del pico debe estar dentro del intervalo de acuerdo con las directrices ICH para el factor de cola, el factor de asimetría, la resolución, el factor de capacidad, el número de placa teórica, la respuesta máxima.
Es una tarea difícil ser lógico antes de cambiar cualquier parámetro después de la validación del método de desarrollo de métodos según las directrices del ICH.
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