Efecto del pH en el análisis HPLC

El desarrollo de métodos en HPLC de fase inversa implica la optimización de diferentes tipos de parámetros de columna y fase móvil. La separación de moléculas ácidas y básicas del pH juega un papel importante en la determinación de la selectividad, el tiempo de retención y en el control de la reproducibilidad y solidez de los métodos. A continuación se muestran algunos puntos sobre cómo el pH de la fase móvil/tampón afecta a sus columnas y el análisis de HPLC puede ayudarlo a determinar rápidamente las mejores condiciones de fase móvil para un analito.

Forma de pico:

El pH del tampón/fase móvil afecta el área del pico y el tiempo de retención del componente porque afecta el estado de ionización. El pH de la fase móvil puede afectar la cromatografía de varias formas. Según la molécula que se analice, el pH puede afectar la forma, la retención y la selectividad del pico. Con una cantidad considerable de analitos no polares, el efecto del pH generalmente no será importante para la retención y resolución. En moléculas básicas, si no se ha determinado el pH específico en función del requerimiento de moléculas específicas, los silanoles de la superficie de sílice se protonan, reduciendo las interacciones con las moléculas básicas que originan los residuos.

Estabilidad y durabilidad de la columna:

El pH del tampón/fase móvil afecta la vida útil y la estabilidad de la columna basada en sílice. La mayoría de los cromatógrafos usan columnas de HPLC entre los rangos de pH de 3,00 a 8,00, pero la degradación de la columna ocurre en este rango de pH por dos mecanismos.

Degradación de la columna a pH más alto:

Un pH de 07,00 o superior es la causa principal de que la sílice se disuelva en la fase móvil acuosa. La velocidad de disolución estará influenciada por muchos parámetros de la columna, incluido el tipo de enlace y la sílice utilizada en el relleno de la columna. La velocidad de disolución de la sílice también se ve afectada por muchos parámetros de la fase móvil, como la composición orgánica, la temperatura de funcionamiento y la fuerza del tampón.

Degradación de la columna a pH más bajo:

A pH bajo (inferior a 03), la hidrólisis ácida de la fase injertada en la superficie de la sílice produce una modificación del tiempo de retención del componente. La reducción del pH aumenta la tasa de hidrólisis.

Reproducibilidad:

La separación reproducible de moléculas se logra eligiendo el pH de la fase móvil que proporcione una buena selectividad y retención, por lo que una columna ofrece una buena durabilidad y forma de pico al pH requerido.