La elección de las fases móviles, el número de componentes de la muestra, la concentración de dos disolventes distintos utilizados, la solubilidad de la muestra, la eficiencia del detector (PDA o UV/VIS) y otros factores pueden afectar a la resolución de la separación HPLC.
La cromatografía líquida de alto rendimiento es una técnica de separación en química, utilizada para el análisis cualitativo y cuantitativo de componentes. En la separación cromatográfica, la resolución de la elución es una medida cuantitativa de cómo se pueden aislar dos picos de analitos.
La resolución es un factor importante de cada tipo de técnica cromatográfica, que viene determinada por tres parámetros importantes como la retención, eficiencia y selectividad. Se define como la disimilaridad de RT entre dos picos, dividida por la anchura de los picos de elución.
Mejorar la máxima resolución de las moléculas estrechamente eluidas es un problema que han encontrado todos los cromatógrafos durante el desarrollo del método HPLC. Las diferencias químicas entre analitos pueden utilizarse para obtener mejores separaciones. Los cromatógrafos utilizan numerosos parámetros para desarrollar la separación de compuestos estrechamente relacionados.
Los parámetros que pueden modificarse para las separaciones preferidas consisten en la fase estacionaria, la fase móvil, el caudal y la temperatura de las columnas. Cambiar el tamaño de la partícula de la columna es otra forma eficaz que utilizan muchos analistas. Las columnas de tamaño de partículas pequeñas generan números de placas teóricos elevados dando forma al pico gaussiano y son capaces de resolver picos muy aislados. Los compuestos que tienen un peso molecular elevado no se pueden separar en una columna de tamaño de poro pequeño, por lo tanto, deben resolverse en una columna de tamaño de poro grande.
La ecuación de resolución establece que tres parámetros principales van a influir en la resolución en cromatografía líquida de alto rendimiento.
1. Factor de retención o factor de capacidad (k):
2. Factor de separación (Selectividad):
3. Eficiencia:
2. Factor de separación (Selectividad):
3. Eficiencia:
La selectividad es el factor que más impacta en la resolución frente a otros factores.
- El tamaño de partícula de la columna
- Dimensión de la columna
- La actividad del adsorbente
- Sobrecarga de la columna
- La temperatura de la columna
- Degradación de la columna HPLC
- Saturación inadecuada de la columna
- pH de la fase móvil
- La polaridad de los disolventes
- Composición de la fase móvil
- La viscosidad de la fase móvil
- La polaridad de la muestra
- el pH de la muestra
- Estructura del soluto
- El caudal del sistema
- Presión sobre el sistema
La elección de una fase móvil (sistema de disolvente) y el volumen de retención o el tiempo de volumen también son los factores más significativos que pueden afectar a la resolución en HPLC, ya que más tiempo para la separación en la columna provoca l extensión de la banda.
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