Cromatografía líquida de alto rendimiento, abreviada como HPLC, es una técnica cromatográfica de gran versatilidad y poder analítico utilizada en muchos aspectos de la fabricación de medicamentos y la investigación.
Separa o identifica mezclas de sustancias en sus componentes en base a su estructura molecular y composición.
El otro nombre para la cromatografía líquida de alto rendimiento es la cromatografía líquida de alta presión.
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Interpretación de Cromatogramas de HPLC: Una Guía Paso a PasoÍndice temático
Introducción
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es la técnica de separación más utilizada. Puede ser muy sensible, específica y precisa.
Es una forma particular de cromatografía de columna utilizada en bioquímica y análisis para separar, identificar y cuantificar los compuestos activos en una mezcla. En HPLC, una columna contiene material de empaquetado (fase estacionaria), una bomba mueve la(s) fase(s) móvil(es) a través de la columna y un detector muestra los tiempos de retención de las moléculas.
El tiempo de retención es variable y depende principalmente de las interacciones entre la fase estacionaria, las moléculas que se están analizando y el(los) solvente(s) utilizado(s).
Lectura relacionada:
Desglose y funciones de las partes de la suspensiónSe introduce una pequeña cantidad de muestra para analizar en la corriente de fase móvil y se retrasa por interacciones químicas o físicas específicas con la fase estacionaria. La cantidad de retardo depende principalmente de la naturaleza del analito y la composición tanto de la fase estacionaria como de la fase móvil. Los solventes más comunes utilizados en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) son metanol y acetonitrilo.
Breve historia
Michael Tswett (1872-1920) es reconocido como el padre de la cromatografía debido a su demostración de cromatografía líquida. En 1903, separó los pigmentos de hojas verdes en bandas de colores. Después, en 1937-38, se utilizó la cromatografía en capa delgada (TLC). El siguiente avance significativo fue el uso de cromatografía en papel en la década de 1940.
La cromatografía en capa fina (TLC) avanzó lentamente durante los años siguientes, pero Egon Stahl realizó un desarrollo significativo en 1956. Egon Stahl estandarizó la preparación de los sorbentes utilizados para fabricar las placas. Más tarde, en la década de 1970, se desarrolló la cromatografía líquida de alta presión (HPLC).
Lectura relacionada:
Bombas HPLC y tipos de bombas HPLCEl término cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se introdujo en la década de 1970 para distinguir la moderna técnica de alto rendimiento de la clásica cromatografía en columna de baja presión, desarrollada en la década de 1930.
Principio de HPLC
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) consiste en la inyección de un pequeño volumen de muestra líquida en un tubo relleno de partículas diminutas (de 3 a 5 micras [µm] de diámetro, denominadas fase estacionaria) en el que los componentes individuales de la muestra se desplazan por el tubo relleno con un líquido (fase móvil) forzado a través de la columna mediante una alta presión suministrada a través de una bomba.
El relleno de la columna se utiliza para separar los componentes entre sí. Esto implica diversas interacciones químicas y/o físicas entre sus moléculas y las partículas del relleno.
Los componentes separados se detectan a la salida de la columna mediante un detector que mide su cantidad. La salida de este detector se denomina "cromatograma de líquidos".
Ventajas sobre la cromatografía líquida en columna de baja presión
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) tiene muchas ventajas sobre la cromatografía líquida tradicional en columna de baja presión.
Mayor sensibilidad (pueden emplearse varios detectores)
Mayor resolución
Velocidad
Fácil recuperación de la muestra (hay que eliminar menos volumen de eluyente)
Gran variedad de fases estacionarias
Ramales en HPLC
La cromatografía se divide en técnicas de gases, líquidos y fluidos supercríticos. La cromatografía de gases se divide a su vez en técnicas gas-líquido y gas-sólido.
La cromatografía de líquidos se divide en una colección relativamente amplia de técnicas como la cromatografía en capa fina. La cromatografía líquida presurizada puede dividirse en intercambio iónico, exclusión, partición y cromatografía líquido-sólido.
Tipos de HPLC
Las siguientes variantes de HPLC dependen del sistema de fase (estacionaria) en el proceso.
1. HPLC de fase normal
- También se conocen como cromatografía de fase normal o de absorción. Este método separa los analitos en función de su polaridad.
- Tiene una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar.
- Por lo tanto, la fase estacionaria suele ser sílice, y las fases móviles típicas son hexano, cloruro de metileno, cloroformo, éter dietílico y mezclas.
- La técnica se utiliza para compuestos sensibles al agua, isómeros geométricos, isómeros cis-trans, separaciones de clase y compuestos quirales.
2. HPLC de fase inversa
- La fase estacionaria es no polar (hidrófoba), mientras que la fase móvil es acuosa, moderadamente polar.
- Funciona según el principio de las interacciones hidrófobas; por tanto, cuanto más apolar sea el material, más tiempo se retendrá.
- Esta técnica se utiliza para moléculas no polares, polares, ionizables e iónicas.
3. HPLC de exclusión por tamaño
- También se conoce como cromatografía de permeación en gel o cromatografía de filtración en gel.
- La columna se rellena con un material con poros de tamaño controlado con precisión, y las partículas se separan en función de su tamaño molecular.
- Las moléculas más grandes se lavan rápidamente a través de la columna; las moléculas más pequeñas penetran en las partículas porosas de la empaquetadura y se eluyen más tarde.
- La cromatografía de exclusión por tamaño también es útil para determinar la estructura terciaria y cuaternaria de proteínas y aminoácidos.
- También se utiliza para la determinación del peso molecular de los polisacáridos.
4. HPLC de intercambio iónico
- En este tipo de cromatografía, la retención se basa en la atracción entre los iones del soluto y los sitios cargados unidos a la fase estacionaria.
- Los iones con la misma carga quedan excluidos.
- Esta técnica se utiliza en la purificación de agua, cromatografía de intercambio iónico y ligando de proteínas, cromatografía de intercambio aniónico de alto pH de carbohidratos y oligosacáridos, etc.
5. HPLC de bioafinidad
- En este tipo de cromatografía, la separación se basa en la interacción reversible de las proteínas con los ligandos.
Instrumentación de HPLC
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Reservorio de Solvente
El contenido de la fase móvil se encuentra en un reservorio de vidrio. La fase móvil o el solvente en HPLC, por lo general, es una mezcla de componentes líquidos polares y no polares cuya concentración respectiva se varía en función de la composición de la muestra.
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Bomba
Una bomba aspira la fase móvil del reservorio de solvente y la fuerza a través de la columna y el detector del sistema. Dependiendo de varios factores, incluyendo las dimensiones de la columna, el tamaño de partícula de la fase estacionaria, la velocidad de flujo y la composición de la fase móvil, se pueden generar presiones de operación de hasta 42000 kPa (alrededor de 6000 psi).
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Inyector de Muestra
El inyector puede ser una inyección única o un sistema de inyección automatizado. Un inyector para un sistema de HPLC debe proporcionar una inyección de la muestra líquida dentro del rango de 0,1-100 mL de volumen con alta reproducibilidad y bajo alta presión (hasta 4000 psi).
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Columnas
Las columnas suelen estar hechas de acero inoxidable pulido, tienen entre 50 y 300 mm de largo y un diámetro interno entre 2 y 5 mm. Comúnmente están llenos de una fase estacionaria con un tamaño de partícula de 3-10 µm. Las columnas con diámetros internos de menos de 2 mm a menudo se llaman columnas microbore. Idealmente, la temperatura de la fase móvil y la columna deben mantenerse constantes durante un análisis.
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Detector
El detector de HPLC, ubicado en el extremo de la columna, detecta los analitos a medida que se eluyen de la columna cromatográfica. Los detectores comúnmente utilizados son los detectores UV-espectroscopía, fluorescencia, masa-espectrométricos y electroquímicos.
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Dispositivos de recolección de datos
Los señales del detector pueden recogerse en gráficos registradores o integradores electrónicos que varían en complejidad y su capacidad para procesar, almacenar y reprocesar datos cromatográficos. La computadora integra la respuesta del detector a cada componente y la coloca en un cromatograma que es fácil de leer e interpretar.
Aplicaciones de HPLC
La información que HPLC puede obtener incluye la resolución, identificación y cuantificación de un compuesto. También ayuda en la separación y purificación química. Las otras aplicaciones de HPLC incluyen:
Aplicaciones farmacéuticas:
- Control de la pureza y calidad de los principios activos.
- Identificación y cuantificación de impurezas y degradación de los compuestos farmacéuticos.
- Control de la estabilidad de los medicamentos.
- Estudio de disolución de tabletas de formas farmacéuticas.
- Control de la homogeneidad de las formulaciones farmacéuticas.
- Análisis de excipientes y su identificación.
- Estudio de la biodisponibilidad de los medicamentos.
- Control de calidad farmacéutico.
Aplicaciones ambientales:
- Detección y cuantificación de contaminantes en el agua, aire y suelos.
- Detección de compuestos fenólicos en agua potable.
- Monitoreo de la calidad del aire.
- Bio-monitoreo de contaminantes.
- Identificación y cuantificación de contaminantes en productos alimentarios.
Aplicaciones en Forense:
- Identificación de sustancias tóxicas en muestras biológicas y no biológicas.
- Cuantificación de drogas en muestras biológicas.
- Identificación de esteroides en sangre, orina, etc.
- Análisis forense de tintes textiles.
- Determinación de cocaína y otros abusos de drogas en sangre, orina, etc.
Alimentos y Sabores:
- Análisis de la composición química de alimentos y bebidas.
- Medición de la calidad de bebidas y agua.
- Análisis de azúcares en jugos de frutas.
- Análisis de compuestos policíclicos en verduras.
- Análisis de conservantes.
- Identificación y cuantificación de aditivos alimentarios.
- Análisis de compuestos volátiles en alimentos y bebidas.
Aplicaciones en pruebas clínicas:
- Análisis de orina, análisis de sangre y otras muestras biológicas.
- Análisis de antibióticos en sangre.
- Análisis de bilirrubina, biliverdina en trastornos hepáticos.
- Detección de neuropéptidos endógenos en el líquido extracelular del cerebro.
- Análisis de marcadores de enfermedades en muestras biológicas.
- Análisis de sangre para medir niveles de glucemia, colesterol, proteínas, hormonas, etc.
- Análisis de orina para evaluar la función renal y la presencia de proteínas, cetonas, bacterias, etc.
- Análisis de tejidos para detectar infecciones, tumores, etc.
- Análisis genético para identificar mutaciones y riesgos de enfermedades hereditarias.
- Análisis de líquido amniótico para evaluar el desarrollo fetal.
- Análisis de sangre para medir los niveles de terapias y medicamentos.
- Análisis de esputo para detectar infecciones respiratorias.
- Análisis de heces para evaluar la salud del sistema digestivo y detectar infecciones.
Limitations
Las limitaciones de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) son las siguientes:
- Alto costo
- Requiere una gran cantidad de materiales costosos
- Puede tener baja sensibilidad para ciertos compuestos y algunos incluso no pueden ser detectados debido a su adsorción irreversible.
- Complejidad
- Las sustancias volátiles se separan mejor por cromatografía de gas.
Preguntas frecuentes
P 1. ¿Qué es la cromatografía líquida?
La cromatografía líquida es una de las tres ramas principales de la cromatografía. Involucra la colocación de una pequeña cantidad de muestra líquida en un tubo empacado con partículas porosas. Los componentes individuales de la muestra son transportados a lo largo de la columna por un líquido movido por la gravedad. Los componentes de la muestra se separan y luego se recolectan en la salida de esta columna.
P 2. ¿Cuál es el principio de la HPLC?
El principio de la HPLC se basa en la distribución del analito entre las fases móvil y estacionaria. Es crucial recordar que los diferentes constituyentes de la muestra eluyen en diferentes momentos antes de lograr la separación de los ingredientes de la muestra. Las interacciones intermoleculares entre las moléculas de la muestra y los materiales de empaque determinan su tiempo en la columna.
P 3. ¿Cuáles son los tipos de HPLC?
Hay cuatro tipos principales de HPLC:
- HPLC de fase normal (método efectivo para separar clases de fosfolípidos)
- HPLC de fase inversa (el método más común utilizado para separar compuestos que tienen moiedades hidrofóbicas)
- HPLC de exclusión de tamaño / cromatografía de tamiz molecular (se utiliza en moléculas grandes / complejos macromoleculares como polímeros industriales y proteínas)
- HPLC de intercambio iónico (separa iones y moléculas polares según su intercambiador iónico).
P 4. ¿Cuáles son los cuatro tipos de cromatografía?
Los cuatro tipos de cromatografía son:
- Cromatografía líquida (se prueba la contaminación en muestras de agua como lagos y ríos)
- Cromatografía de gas (se detectan bombas y valiosas en investigaciones forenses)
- Cromatografía de capa fina (se utiliza para verificar la pureza de compuestos orgánicos, como la presencia de insecticida o pesticida en alimentos)
- Cromatografía en papel (utiliza una tira de papel en la fase estacionaria).
P 5. ¿Por qué se necesita alta presión en HPLC?
HPLC utiliza una presión moderada a alta para lograr la tasa de flujo deseada del disolvente a través de la columna cromatográfica, ya que las partículas pequeñas tienen una mayor resistencia al flujo.
P 6. ¿Cuál es la diferencia entre isocrático y gradiente?
Su aplicación se puede realizar de diferentes maneras, isocrática y gradiente. El isocrático es cuando la mezcla de fase móvil es constante durante el tiempo total de prueba. Con un gradiente, la composición de la mezcla de eluyente cambia durante la medición, lo que afecta significativamente la retención del analito. Puede acelerar o desacelerar el proceso de separación.
P 7. ¿Qué disolvente se utiliza en HPLC?
En HPLC se utilizan diferentes disolventes, como disolvente acuoso (agua) y disolvente orgánico (metanol, acetonitrilo y propanol). Para mejorar la forma de pico cromatográfico, se pueden usar ácidos como ácido acético, ácido fórmico y ácido trifluoroacético.
P 8. ¿Cuál es la diferencia entre los detectores UV y PDA?
El PDA y el UV son ambos detectores de absorción, que brindan sensibilidad para compuestos que absorben la luz. El detector UV es el más comúnmente utilizado para el análisis de HPLC. La absorción UV difiere en la longitud de onda utilizada, por lo que es esencial elegir la longitud de onda adecuada en función del tipo de analito. Por otro lado, el detector PDA agrega una tercera dimensión de longitud de onda, que es una forma más conveniente de descubrir la longitud de onda sin repetir el análisis.
P 9. ¿Cuáles son las ventajas de la HPLC?
Las ventajas de la HPLC son las siguientes:
- Se pueden probar tanto materias primas como productos terminados.
- Se pueden hacer ingeniería inversa de formulaciones.
- Ayuda a solucionar problemas de fallas de productos.
- Puede detectar contaminantes y otras impurezas.
- Puede realizar análisis de productos de competidores.
- Puede determinar la estabilidad y la vida útil del producto.
- La prueba se puede realizar con una muestra de tamaño pequeño.
- Te permite modificar la prueba según el nivel de cuantificación necesario.
- Los resultados producidos son confiables.
- Ayuda a desarrollar mejores productos.
- Te permite tener una mejor comprensión de los productos de los competidores.
P 10. ¿Qué es el valor Rf?
En cromatografía, el valor Rf se refiere a la distancia que recorrió un componente específico dividido por la distancia recorrida por la frente de solvente. En otras palabras, es la característica del componente que ayuda en la identificación de los componentes.
P 11. ¿Cuáles son los dos tipos principales de cromatografía?
Hay diferentes tipos de cromatografía, pero los dos tipos principales son la cromatografía líquida y la cromatografía de gases.
P 12. ¿Qué es el tiempo de retención?
Es cuando un analito específico sale del final de la columna.
Referencias:
- Malviya, Rishabha & Bansal, Vvipin & Pal, Om & Sharma, Pramod. (2010). High-performance liquid chromatography: A short review. Journal of Global Pharma Technology. 2. 22-26.
- https://microbenotes.com/high-performance-liquid-chromatography-hplc/
- https://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html
- https://www2.chemistry.msu.edu/courses/cem434/Swain_2015_Lecture%20Notes/HPLC%20Lecture1a.pdf
- https://www.nature.com/subjects/liquid-chromatography
- https://www.knauer.net/en/Systems-Solutions/Analytical-HPLC-UHPLC/HPLC-Basicsprinciples-and-parameters
- https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=8468
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5702474/
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