Principio y procedimiento de HPLC

HPLC es una técnica analítica en química para la separación, identificación y cuantificación de mezclas de muestras. La cromatografía líquida de alta resolución es una de las herramientas más poderosas de la química analítica actual. Dado que está separado, identifique y cuantifique los analitos presentes en una mezcla de muestras que pueda disolverse en líquido.

Todas las separaciones cromatográficas, como la cromatografía en capa fina (TLC), la cromatografía en columna, la HPTLC y la cromatografía en papel funcionan según el mismo principio básico. HPLC es principalmente una forma muy avanzada de cromatografía en columna. El principio de HPLC se basa en la distribución del componente entre una fase estacionaria (columna de HPLC) y una fase móvil (disolvente). Dependiendo de la estructura química de las moléculas, se retrasa su transición a la fase estacionaria. Las interacciones intermoleculares entre las moléculas de una muestra y el material de envasado determinan su período en columna. Por lo tanto, diferentes componentes de una mezcla de muestra eluyen en diferentes tiempos de retención.

HPLC en fase normal: NP-HPLC separa las moléculas según la polaridad, en la que se utilizan fase estacionaria polar y fase móvil no polar.

HPLC de fase inversa: La cromatografía de fase inversa funciona según el principio de las interacciones hidrofóbicas, por lo que cuanto más no polar sea el analito, más tiempo se retendrá. En este, la fase móvil es polar y la fase estacionaria es de naturaleza no polar.

HPLC por exclusión de tamaño: La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es un proceso cromatográfico que separa las moléculas basándose únicamente en su tamaño. En esta técnica, el material de relleno de la columna separa las moléculas basándose en su exclusión de los poros.

HPLC de intercambio iónico: Se utiliza para separar iones y moléculas polares según su afinidad con el intercambiador de iones. La cromatografía de intercambio iónico es el método más popular para la purificación de proteínas y otras moléculas cargadas.

Antes de comenzar un experimento de HPLC, debemos reconocer los diversos componentes esenciales para realizar el proceso.

bomba HPLC: La bomba de HPLC produce alta presión que proporciona un flujo continuo y repetible de fase móvil en todo el sistema de HPLC. Por ejemplo, bomba de pistón, bomba de jeringa y bomba neumática.

Fase móvil de HPLC: Es un solvente o contiene una combinación de agua con solventes orgánicos, una cantidad ideal de una solución acuosa con solventes polares o mezclas de solventes orgánicos.

Desgasificador HPLC: Es una herramienta de desgasificación de fase móvil utilizada en HPLC.

Inyector HPLC: Un inyector de muestra es un dispositivo que se utiliza para inyectar una solución de muestra en el sistema de HPLC. Por ejemplo, inyector de Rheodyne, inyector de septum e inyector de flujo de parada.

columna de HPLC: La columna es el componente clave de HPLC ya que es responsable de separar los analitos de la mezcla de muestra. Las columnas ahora están diseñadas para su uso a alta presión en tubos de acero inoxidable. Generalmente, el gel de sílice se llena en la columna de HPLC conocida como fase estacionaria.

Horno de HPLC: Es un dispositivo utilizado para controlar la temperatura de una columna.

Detector de HPLC: Un detector es un dispositivo utilizado para detectar compuestos separados de una columna. El detector transforma el efluente en una señal eléctrica y es registrada por el sistema computarizado. Por ejemplo, detector UV/VIS, detector PDA, detector de masas (LCMS), detector de fluorescencia y detector de infrarrojos, etc.

• Instale la columna (C8/C18) correctamente según sea necesario.
• Preparar la fase móvil y llenarla en el depósito. (disolvente, tampón o combinación de los mismos)
• Prepare muestras a diferentes concentraciones según sea necesario.
• Cree un método y complete parámetros como el caudal, la composición de la fase móvil, la longitud de onda, la temperatura del horno y la duración del programa.
• Cree una secuencia de muestra y guárdela.
• Drene los tanques.
• Aumente gradualmente el caudal del sistema hasta el caudal requerido y espere hasta que la columna se sature y se corrija la línea de base.
• Cuando obtenga una línea de base, inyecte la muestra manualmente o con un inyector automático a través de un inyector (bucle de muestra/jeringa).
• Después de analizar la muestra, estudie el tiempo de retención, el factor de cola, el factor de capacitancia y las placas teóricas de cada pico.
• Repita el proceso dependiendo del número de muestras.
• Lave bien la columna con agua de grado HPLC y metanol/acetonitrilo.

• Para aplicaciones farmacéuticasLa HPLC se utiliza para el control de la estabilidad de los medicamentos, el análisis de la disolución de tabletas de forma de dosificación farmacéutica y el control de calidad, etc.
• Para aplicaciones ambientales, La HPLC se utiliza para el control biológico de contaminantes y la detección de compuestos fenólicos en el agua potable, etc.
• Para aplicaciones forenses, La HPLC se utiliza para la cuantificación de drogas en muestras biológicas, determinación de cocaína, esteroides y otras drogas utilizadas en sangre, orina, etc.
• Para aplicaciones clínicas, HPLC se utiliza para el análisis de orina, bilirrubina, antibióticos, etc. en la sangre.
• Para aplicaciones de alimentos y bebidasHPLC se utiliza para el análisis de compuestos policíclicos en vegetales, el análisis de conservantes, azúcar y para la medición de la calidad del agua y refrescos.

• La cromatografía líquida de alta resolución proporciona un método simple, automatizado y de alta precisión para identificar ciertos componentes químicos en una muestra.
• HPLC proporciona un análisis cuantitativo y cualitativo simple y preciso.
• Puede ser una actualización de la espectroscopia de masas.
• En comparación con otras técnicas cromatográficas, como la cromatografía en columna, la TLC y la cromatografía en papel, la HPLC es rápida, eficiente y ofrece una alta resolución.
• El gradiente de elución es fácilmente adaptable en HPLC.

• Esto requiere una gran cantidad de costosos solventes, fuentes de alimentación y mantenimiento regular.
• Necesita ser experto porque es más difícil para los principiantes.
• La fiabilidad del proceso de separación por HPLC depende de la limpieza de la fase móvil, de la muestra y del buen funcionamiento del sistema.
• La columna contaminada puede afectar las formas de los picos.

El principio básico de HPLC es separar moléculas entre la fase estacionaria y la fase móvil. Dado que las moléculas tendrán diferentes coeficientes de partición, se separarán sobre esta base.

HPLC de fase normal, HPLC de fase inversa, HPLC de exclusión por tamaño y HPLC de intercambio iónico, etc. son los tipos de HPLC basados ​​en el sistema de fase (estacionario) en el proceso.

Una de las principales ventajas de la cromatografía líquida de alta resolución es que tiene la capacidad de analizar una amplia variedad de muestras.

La principal diferencia entre HPLC y HPTLC es que HPLC separa una mezcla de muestras usando una columna, mientras que HPTLC usa una placa.

• Asegúrese de lavar la columna antes y después de la ejecución.
• Los disolventes deben filtrarse a través de una membrana de filtro de nailon de 0,5 μm y desgasificarse.
• La muestra debe estar libre de partículas, por lo tanto filtrada a través de una membrana de filtro de nailon de 0,2 μm.
• Tampones como tampones de fosfato, tampones de acetato, etc. son muy dañinos para el sistema de HPLC y las columnas deben lavarse adecuadamente.
• No sobrecargue la columna.
• Utilice caudales apropiados para mantener la presión del sistema.
• No opere los sistemas de HPLC a alta contrapresión.
• Utilice siempre disolventes de grado HPLC y agua de fuentes fiables.
• Utilice precolumnas para protegerse contra la contaminación y prolongar la vida útil de la columna.
• No utilice fase móvil o tampones con un pH muy ácido o básico.