Una descripción general de los factores que contribuyen a apagar la fluorescencia

El análisis basado en las propiedades de fluorescencia de los materiales mediante análisis fluroimétrico es una técnica muy sensible. A concentraciones más bajas (niveles de ng o menos), la técnica muestra una mayor sensibilidad en comparación con la espectroscopia UV-Vis. Dos factores importantes contribuyen a la alta sensibilidad de las determinaciones fluorimétricas.

Número limitado de moléculas fluorescentes – una gran cantidad de moléculas absorben significativamente en el rango UV-visible, pero no muestran una fluorescencia apreciable. Un número relativamente pequeño de moléculas exhibe fluorescencia. Esto da como resultado una menor interferencia de compuestos que muestran absorción en la región UV-Vis.

Elección de longitudes de onda de excitación y emisión – En comparación con la espectroscopia UV-visible, en la que solo se dispone de una única longitud de onda para la radiación y la absorción, la fluorescencia proporciona dos longitudes de onda (excitación y emisión). Esta función es útil para resolver muestras con espectros de absorción superpuestos pero que muestran fluorescencia a diferentes longitudes de onda. De manera similar, dos moléculas con espectros de fluorescencia similares se pueden distinguir mediante la elección selectiva de longitudes de onda de excitación.

Las mediciones fluorimétricas ofrecen una mayor sensibilidad, pero tienen una limitación que resulta en una disminución de la intensidad de la fluorescencia debido a una serie de procesos, como la autoextinción, la autoabsorción y los efectos de filtrado interno. La extinción de la fluorescencia es un término general que describe la reducción de la intensidad debido a la interacción del fluoróforo con su entorno adyacente.

autoextinguible

La autoextinción implica la pérdida de energía a través de colisiones entre las moléculas en estado excitado y fundamental. Esto da como resultado la reducción de moléculas en estado excitado que se relajan por las emisiones de fluorescencia. La autoextinción aumenta en proporción directa a la velocidad a la que se producen las colisiones. Un aumento en la concentración de un analito conduce así a una disminución en las emisiones de fluorescencia.

Autoabsorción o efecto celular interno

En algunas moléculas, la longitud de onda de absorción puede superponerse a la longitud de onda de la banda de fluorescencia emitida. En tales situaciones, algunos fotones emitidos pueden reabsorberse antes de que puedan salir de la solución. En cierto sentido, la autoabsorción es similar a la autoextinción y puede conducir a una dependencia de concentración no lineal en concentraciones más altas.

extinción de oxígeno

Las propiedades paramagnéticas del oxígeno pueden provocar una disminución significativa de la intensidad de la fluorescencia. Esto ha sido discutido antes. Asimismo, la presencia de metales de transición con electrones desapareados puede resultar en una reducción de la intensidad de la fluorescencia.

Esencialmente, la fluorescencia es una técnica altamente sensible capaz de determinar especies fluorescentes de bajo nivel. La dilución de la solución resulta beneficiosa porque reduce los efectos de autoextinción y autoabsorción. La extinción del oxígeno se puede reducir desgasificando previamente la muestra con una corriente de gas nitrógeno libre de oxígeno.