A continuación se mencionan algunos factores que afectan a la cromatografía en fase inversa.
El caudal del sistema:
Se considera que el caudal es un factor importante en la resolución de pequeños analitos, incluidos los digeridos de proteínas y los péptidos pequeños en separaciones de fase inversa.
Longitud de la columna utilizada:
La longitud de la columna afecta al tiempo de retención. Si se reduce la longitud de la columna, la RT de la molécula también se reduce proporcionalmente.
La temperatura del sistema:
La temperatura puede tener un efecto intenso sobre RP-HPLC específicamente para las moléculas de bajo peso atómico. La viscosidad de la fase móvil utilizada en la cromatografía de fase inversa se reduce con el aumento de temperatura de la columna HPLC. Dado que el transporte de masa de moléculas es un proceso controlado por difusión entre la fase estacionaria y la fase móvil, la baja viscosidad del disolvente suele conducir a una transferencia de masa altamente eficiente y, en consecuencia, una alta resolución.
Método de elución en gradiente:
En algunas biomoléculas y algunos analitos, deben utilizarse métodos de elución en gradiente porque son difíciles de separar o el número de componentes es mayor en la muestra. Los métodos de elución de gradiente pueden afectar a algunas separaciones de cromatografía en fase inversa.
La fase móvil del sistema:
La fase móvil de la cromatografía en fase inversa consta de fases orgánicas y acuosas como metanol, acetonitrilo, agua y tampón. Sin embargo, las soluciones de fase móvil tienen capacidades ligeramente amortiguadoras porque generalmente tienen un ácido fuerte a pH bajo con grandes cantidades de disolventes orgánicos. Cuando se trabaja cerca de condiciones fisiológicas, debe mantenerse una capacidad de amortiguación adecuada.
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