Cómo evitar el pico de cola en la cromatografía HPLC

La contaminación de la columna es la causa más común del pico de cola en analitos no activos. En HPLC y cromatografía de gases, la distorsión de la forma del pico cromatográfica más habitual es la cola del pico. El pico de cola muestra cuando el factor de asimetría del pico (As) es superior a 1,2, mientras que muchos ensayos aceptan picos con un factor de asimetría de más de 1,5.

Una buena forma simétrica nítida, un pico gaussiano, con una resolución suficiente sobre una línea de base plana, es un pico cromatográfico ideal. Una cima puede desviarse de este ideal por distintos motivos. Puede llegar a ser asimétrico, allanarse y más ancho, o aumentar su línea de base.

Los picos anchos, los picos divididos y las alturas variables de los picos en HPLC pueden ser muestras llenadas imperfectamente en el bucle de muestra o inyector, incompatibilidad de los disolventes de la muestra con la fase móvil. Es bueno disolver e inyectar los componentes de la muestra en la fase móvil siempre que sea posible. O bien, asegúrese de que el disolvente de inyección sea de menor resistencia en comparación con la fase móvil.

Tenga en cuenta que varios muestreos automáticos utilizan diferentes soluciones de lavado de jeringuillas. Asegúrese de que esta solución es más débil que la fase móvil y es compatible con ella. Esto es especialmente significativo cuando se intercambia entre análisis de fase inversa y normal.

Las columnas de protección y los filtros impiden que los compuestos y partículas que retienen fuertemente se acumulen en la columna HPLC. La vida útil de estos dispositivos depende de la composición de la fase móvil, el pH de la fase móvil y la pureza de la muestra, etc. A medida que estos productos se tapan o contaminan con partículas, la presión del sistema aumenta y los picos se amplían.

Causas del pico de cola en la cromatografía HPLC:

No sobrecargue la columna.
Si el tiempo de retención es demasiado largo, muestra un pico de cola. Modifique el método de esta manera que los picos elucen antes.
Grandes cantidades de extra-columna provocan un pico de cola, por tanto, cuando sea posible, reduciendo el diámetro del tubo y la longitud de la columna a proteger, especialmente en las post-columnas.
La precipitación de la muestra provoca una disolución lenta de los analitos y provoca un pico de cola, así que asegúrese de que la molécula sea correctamente soluble con su disolvente.
Si el tiempo del detector es demasiado lento, aumente la frecuencia Hz del detector.
Si el volumen de la columna es demasiado grande, se produce una cola, por tanto, se reducen las longitudes y diámetros de los tubos siempre que sea posible, principalmente después de la columna.
Los daños físicos en la columna, las piezas del inyector y la pérdida de inerteza de la tubería también son causas del pico de cola y fronting.
Recubrimiento u obstrucciones en la frita de la columna o partículas de empaquetamiento de la columna.
Debido al uso de una columna contaminada.
Las columnas y filtros de guardia obstruidos o sucios causan cola.
Cuando sólo tiene cola para uno o dos picos, puede haber un contaminante interfiriendo que coexista.

Para evitar el pico de cola en el cromatograma, rectificar el punto mencionado anteriormente, existen algunas formas que se pueden utilizar mientras se realiza el experimento o el trabajo de investigación.

Cómo evitar el pico de cola:

Siempre que sea posible, prepare la muestra en la misma fase móvil que utilice para la separación.
Inyecte una muestra mínima al inyector para evitar la sobrecarga de la columna.
Utilice un pH más bajo de la fase móvil para hacer funcionar el instrumento.
Utilice una columna muy desactivada.
Debe considerarse la posibilidad de sobrecarga masiva.
Se debe considerar la posibilidad de deformación del lecho de la columna.
Compruebe el valor de pKa del analito y mantenga el pH de la fase móvil según sea necesario (+/- 2 pH de pKa).
Filtra siempre la muestra y la fase móvil para evitar interferir con contaminantes.
Haga un uso adecuado del proceso de limpieza de muestras que sea necesario.