¿Cómo reducir la ampliación del pico en HPLC?

El ensanchamiento del pico es una ocurrencia en la separación por cromatografía líquida de alto rendimiento que disminuye la eficiencia de la separación y provoca una mala resolución de los analitos. Los picos ideales en cromatografía son simétricos y gaussianos. En los picos asimétricos aparece el fronting de pico o la cola. Puede producirse un pico frontal o un desgaste debido a la mala calidad de la columna HPLC o el volumen muerto del sistema.

La ampliación del pico es causada por una serie de factores que se mencionan aquí, y evitarlos puede ayudar a reducir el ensanchamiento del pico en HPLC.

- La ampliación del pico está influenciada por el caudal de la fase móvil y el tamaño de las partículas del material de embalaje en las columnas HPLC. Cuanto menor sea la partícula con esta última, mejor será la resolución máxima.
- Las columnas pequeñas y las grandes cantidades de muestra conducen a un ensanchamiento máximo.
- Asegúrese del volumen inyectado y la concentración del componente objetivo en la muestra.
- La composición de la fase móvil en modo gradiente son torres escarpadas que cambian de polar a no polar en muy poco tiempo.
- La precipitación en la muestra provoca una disolución lenta y la liberación del componente; debe centrifugar y filtrar antes de cargarlo en el inyector.
- Comprobar el número de placas teóricas para columnas cromatográficas y regular su carga en consecuencia.
- Utilice la longitud de onda adecuada del analito.
- Si el caudal actual no funciona, puede trabajar con un caudal más alto para obtener una forma de pico simétrica.
- Asegúrese de que no haya fugas entre la columna y el detector.
- Tubo demasiado largo entre la columna y el detector HPLC.
- A veces, el ID del tubo es demasiado grande, lo que hace que el pico se amplíe.
- Hacer factible inyectar la muestra en el mismo disolvente que se utiliza en la fase móvil.
- Compruebe periódicamente el rendimiento de las columnas; las columnas más antiguas reflejan los picos de cola y otros problemas de rendimiento.
- Mientras sólo se utiliza agua en la fase móvil, puede ser esencial gestionar el pH para controlar la carga de las moléculas de interés.
- Se considera que los tampones pueden mejorar la forma del pico cuando se seleccionan en el nivel de pH adecuado para controlar la ionización.
- Puede reducir la ampliación del pico utilizando diferentes tipos de tampones como soluciones de acetato o fosfato, ajustadas al pH adecuado según el valor de pKa de la molécula.