Cromatografía de fase inversa: una visión general

Aprender sobre el principio de la cromatografía en fase inversa y aprender la fase estacionaria, la fase móvil y las aplicaciones de la cromatografía líquida en fase inversa.

¿Qué es la HPLC de fase inversa?

La cromatografía de fase inversa es un tipo de cromatografía líquida de alto rendimiento, que se utiliza para separar a los solutos en función de las interacciones hidrofóbicas entre la fase móvil y la fase estacionaria. RP-HPLC es el modo HPLC más utilizado, y este modo es exactamente lo contrario de la cromatografía de fase normal, en la que la fase móvil es más polar que la fase estacionaria. Por lo general, la fase estacionaria de la cromatografía en fase inversa es no polar (columna sílice-C18) y una fase acuosa móvil moderadamente polar.

Principio de HPLC de fase inversa:

• El principio de la cromatografía en fase inversa se basa en la interacción de moléculas con el grupo hidrofóbico.
• La cromatografía líquida en fase inversa es un proceso de adsorción que depende de un mecanismo de partición para aislarlo. La fase estacionaria En RP-HPLC es un soporte sólido aplicado con grupos hidrófobos e hidrófilos.
• Esta distribución se basa en las propiedades de unión del medio, la hidrofobicidad de los analitos y la composición de la fase móvil.
• La polaridad de una molécula que es similar al empaquetamiento de la columna, su tiempo de retención es mayor a medida que son atraídos por las partículas con mayor fuerza. La molécula de polaridad que es similar a la fase móvil será preferiblemente atraída por ella y se moverá rápidamente desde la columna HPLC.

La columna es el corazón de la cromatografía HPLC y la fase móvil puede utilizarse para controlar la retención y la selectividad de la separación. La columna HPLC de fase inversa se llena con partículas de sílice. Las partículas normalmente se caracterizan por el tamaño de las partículas y el tamaño de los poros. Los tamaños de partículas varían normalmente de 3 a 50 micras, el tamaño de partícula de 5 um es el tamaño de partícula más utilizada. La fase estacionaria de RP-HPLC se compone normalmente de cadenas alquiles hidrofóbicas que interaccionan con los componentes. C4, C8 y C18 son tres longitudes de cadena que se utilizan habitualmente en la cromatografía de fase inversa.

En HPLC se utilizan distintos tipos de columnas; sin embargo, el C18 (Octildecilsilano) es la fase estacionaria más utilizada del HPLC de fase inversa. Tiene 18 carbonos que se unen a la sílice, que es más y una cadena de carbono más larga que otras columnas utilizadas en RP-HPLC. Al tener 18 cadenas de carbono, tiene una superficie mayor que da más tiempo de interacción entre los compuestos y la fase unida. Ésta es la principal razón por la que cubre una amplia gama de muestras.

 

Existen dos tipos de embalaje de columna de cromatografía de fase inversa que se utilizan de la siguiente manera.

• Gel de sílice con cadenas alquiles unidas químicamente
• Embalaje a base de resina

 

La fase móvil de la cromatografía en fase inversa (RP-HPLC):

El papel de la fase móvil en la cromatografía en fase inversa es controlar la retención y selectividad de compuestos neutros e ionizados. En muchos métodos desarrollados por RP-HPLC utilizan una mezcla de disolvente orgánico miscible (metanol/acetonitrilo) y agua como fase móvil. La razón de los disolventes orgánicos es mantener la polaridad en niveles adecuados del compost para disolverse en el sistema de disolventes y, sin embargo, lo suficientemente alta como para facilitar la unión con la fase estacionaria de la molécula preferida. En algunos desarrollos del método HPLC, se pueden añadir agentes de apareamiento de iones en la fase móvil. Cuando el compuesto a separar entra en la matriz de la columna, se deja disociar disminuyendo aún más la polaridad aumentando la concentración de disolvente orgánico en el sistema de disolventes. Este proceso de cambio de la concentración de disolvente orgánico en la fase móvil para aislar un compuesto se llama elución gradiente.

En algunos análisis o investigaciones farmacéuticas, varios fármacos son ionizables, es decir, ácidos o básicos. Por tanto, es necesario controlar el pH de la fase móvil, ya que puede tener un gran impacto en la retención de componentes. Dependiendo del pH de la fase móvil, los compuestos ionizables que existen en formas ionizadas o no ionizadas y los ionizados tienen una retención significativamente menor que los no ionizados en cromatografía líquida de fase inversa.

Un tampón es una solución de un ácido débil y su base conjugada, o una base débil y su ácido conjugado. Significativamente, el tampón tiene un pKa cercano al pH preferido para que los tampones controlen mejor el pH de su pKa. Diferentes tipos de tampones como el tampón fosfato, el tampón acetato, el tampón de formiado, el ácido fosfórico y sus sales de sodio o potasio son los tampones habituales para HPLC de fase inversa. Los diferentes disolventes como el acetonitrilo y el metanol son los disolventes orgánicos más utilizados en RP-HPLC.

 

Aplicaciones de la cromatografía en fase inversa (RP-HPLC):

La cromatografía de fase inversa es un método analítico importante utilizado para separar a los analitos, que se utiliza ampliamente en el análisis de productos farmacéuticos, investigación en ciencias de la vida, medicina forense, industrias químicas, biotecnología, industrias alimentarias y diagnóstico clínico.

Ventajas de la HPLC de fase inversa:

• Es la técnica más utilizada de todo el método HPLC, puesto que aísla una gran variedad de muestras.
• En RP-HPLC el agua puede utilizarse en fase móvil con otros disolventes.
• Este método de separación puede ser estable en todos los valores de pH ácidos y básicos.
• Es una técnica cromatográfica económica.
• Ofrece resultados precisos incluso con la mínima cantidad de muestras.

 

Las preguntas más frecuentes sobre HPLC son las siguientes.

¿Cuántos tipos de inyección existen en HPLC?

Los tres tipos de inyectores se utilizan en HPLC, como el inyector Rheodyne, el inyector de septum y el inyector de parada de flujo.

¿Cuáles son los distintos tipos de detectores utilizados en HPLC?

Detector UV/VIS, matriz de fotodiodos (PDA), espectrómetro de masas, fluorescencia, índice de refracción, electroquímica, conductividad eléctrica y dispersión de la luz son los tipos de detectores utilizados en HPLC.

¿Cuáles son los tipos de cromatografía HPLC?

Existen cuatro tipos de HPLC, tales como HPLC de fase inversa, HPLC de fase normal, HPLC de exclusión de tamaño y HPLC de intercambio iónico.

¿Cuántos tipos de bombas existen en HPLC?

Existen tres tipos de bombas: bomba alterna, bomba de jeringa y bomba neumática que proporcionan la presión y los caudales necesarios.

¿Qué es la elución isocrática y gradiente?

Existen dos tipos de elución en HPLC, es decir, isocrática y gradiente. En la elución isocrática, se bombea una composición constante de la fase móvil a través de la columna durante todo el análisis y en la elución en gradiente, la composición de la fase móvil se cambia constantemente durante la ejecución.