Desarrollo del método HPLC para compuestos ácidos

La acidez o basicidad de una muestra normalmente se define por el valor del pH. La elección de un pH adecuado para moléculas ionizantes a menudo crea picos agudos y simétricos en HPLC. La forma simétrica del pico es esencial en el análisis cuantitativo para conseguir límites de detección más bajos. Para los ácidos débiles, los valores de pKa suelen estar en el rango de 4 a 6. Por tanto, a un valor de pH de 3 o menos, el ácido debe existir como molécula neutra. En un valor de pH de 7 o superior, el ácido tiene una carga negativa. El estado de carga del analito es extremadamente significativo en la separación de la cromatografía líquida de alto rendimiento; por eso se necesita casi constantemente algún tipo de modificación del pH.

Un analito cargado normalmente tiene una mayor solubilidad en agua en comparación con un compuesto neutro y, por tanto, tiene una retención mucho menor en una columna de fase inversa. Si queremos utilizar una columna de fase inversa, el ácido debe estar en su forma neutra, donde la retención debe ser alta. Si los compuestos tienen algunos o ningún grupo polar y contiene un número considerable de carbonos, nuestro trabajo es normalmente bastante fácil.

Preferimos utilizar ácido fórmico al 0,1% o ácido fosfórico al 0,1%, todos los cuales deben mantenerse en su forma neutra. Posteriormente, establecemos la cantidad de disolvente orgánico según sea necesario, una menor cantidad de disolvente orgánico significa más tiempo de retención de una molécula. Si el analito es más polar, el tiempo de retención puede disminuir en cualquiera de estas fases.