Guía de selección del tampón de HPLC

La cromatografía líquida de alto rendimiento separa las moléculas en las que la fase estacionaria y fase móvil son factores significativos, en las que también se utilizan los tampones con la fase orgánica en el análisis.

Aquí se mencionan algunos consejos de selección de tampón para HPLC.

La selección de tampones adecuados para el análisis depende de las características del tampón, por ejemplo, el rango de pH, el pKa y el corte UV.
Como regla común, el tampón de pH debe utilizarse con un valor de pKa de +/- 1 compuesto. Los tampones dentro de ese rango resisten el cambio de pH.
Si el pH de la fase móvil del tampón fosfato es superior a 7, acelerará la disolución de la sílice, dando lugar a daños en la columna o acortará la vida útil de la columna. Normalmente, el rango de pH de RP-HPLC en embalajes a base de sílice es de 2,00 a 8,00.
Preferiblemente debe escogerse la concentración más baja que produzca resultados reproducibles. Normalmente, una concentración de tampón de 10 a 50 mM es suficiente para la separación de componentes.
Si la cantidad de modificadores orgánicos en los tampones es baja o no, el crecimiento microbiano puede producirse rápidamente, este crecimiento se acumulará en las entradas de la columna HPLC y puede causar daños y disminuir el rendimiento de la columna. Por tanto, se utilizan soluciones tampón recién preparadas.
La solución tampón debe filtrarse a través de un filtro de nylon de 0,5 micras.
La fase móvil del HPLC debe desgasificarse.
La solubilidad del fosfato es en agua, metanol, acetonitrilo y tetrahidrofurano (THF).
Algunos tampones de sal son higroscópicos, lo que podría cambiar los resultados de la cromatografía.
La solubilidad de las sales de amoníaco suele ser en agua o en fases móviles orgánicas.
El ácido trifluoroacético (TFA) puede degradarse con el paso del tiempo, absorbe el detector UV a longitudes de onda inferiores.
Los tampones de bicarbonato de amonio son generalmente propensos a cambios de pH y suelen ser estables hasta 48 horas.
Los tampones de HPLC utilizados habitualmente son el acetato de amonio, el formato de amonio, el dihidrógeno fosfato de potasio o el ácido fosfórico, el hidróxido de amonio, el ácido trifluoroacético, el ácido fórmico, etc .
Hoy en día, los problemas más comunes asociados con la compatibilidad con la detección, el formato y los buffers de acetato de espectroscopia de masas son opciones ideales.