La cromatografía HPLC tiene distintos tipos que se basan en el principio de separación, modos de cromatografía, tipos de análisis, escala de funcionamiento y modo de elución.
La cromatografía es una técnica analítica en química utilizada para aislar y analizar mezclas complejas de analitos. La cromatografía funciona distribuyendo una mezcla de compuestos entre dos fases, es decir, fase móvil y fase estacionaria. La cromatografía líquida utiliza un líquido o disolvente como fase móvil, mientras que la fase estacionaria se empaqueta en una columna o superficie plana.
El aislamiento de todos los métodos de cromatografía, incluyendo HPLC, TLC, cromatografía en columna y cromatografía en papel funciona bajo el mismo principio básico. Los compuestos se separan por su distinta afinidad por la fase estacionaria utilizada en el sistema de cromatografía.
La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es una versión muy avanzada de la cromatografía en columna. Más bien permitiendo que un disolvente caiga por gravedad a través de una columna, se fuerza a alta presión mediante una bomba HPLC, lo que le convierte en un método muy rápido y muy preciso.
A través de ella pasan las fases estacionarias (sólidos) que están empaquetadas en una columna (generalmente sílice) y la fase móvil (líquida). También permite utilizar un tamaño muy pequeño de las partículas para el material de embalaje de la columna HPLC, lo que da una superficie muy elevada para la interacción entre la fase estacionaria y los componentes que viajan.
Por tanto, obtenemos una mejor separación de los componentes de la mezcla de muestra. Los analitos de la mezcla de muestra se separan en función de su polaridad; depende de la técnica de cromatografía que se utilizará para el análisis.
Índice temático
Diferentes tipos de HPLC:
El HPLC tiene varias formas que se basan en los modos de cromatografía, el principio de separación, el método de elución, el tipo de análisis y la escala de operación, compruébalo.
- Basado en los modos de cromatografía:
- Basado en el principio de separación:
La cromatografía de adsorción, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de pares de iones, la cromatografía de permeación en hielo o de exclusión de tamaño y la cromatografía quiral, etc.
- Según el método de elución seguido:
Elución isocrática y elución gradiente
- Según el tipo de análisis:
Análisis cuantitativo y análisis cualitativo
- Según la escala de operación:
HPLC de tipo preparativo y HPLC de tipo analítico
Dependiendo de la fase estacionaria del método, existen cuatro tipos de HPLC, es decir, HPLC de fase inversa, HPLC de fase normal, HPLC de exclusión de tamaño y HPLC de intercambio iónico para separar las moléculas..
HPLC de fase inversa:
La RP-HPLC es una técnica cromatográfica en la que la fase móvil es polar, acuosa y la fase estacionaria no polar (hidrofóbica). Las partículas de la columna de fase inversa suelen estar recubiertas de cadenas de carbono, por ejemplo, C8/C18. Entre todos los tipos de métodos HPLC, utilizamos alrededor del 70% de este proceso debido a su amplia aplicabilidad y reproducibilidad.
HPLC en fase normal:
NP-HPLC es la forma clásica de cromatografía; a diferencia de la cromatografía de fase inversa, utiliza la fase móvil no polar y la fase estacionaria polar (hidrofílica). Si este mecanismo de separación depende de la adsorción, también se conoce como cromatografía de adsorción basada en la fase estacionaria seleccionada.
Más concretamente, esta técnica es que el proceso móvil es 100% de disolventes orgánicos. Esto significa que no se utiliza agua para la separación de compuestos.
HPLC de exclusión de tamaño:
La exclusión de tamaño o la cromatografía de filtración en gel requiere partículas estacionarias porosas, atrapando partículas de menor tamaño y permitiendo que las moléculas de mayor tamaño se muevan más rápidamente. La columna de cromatografía de exclusión de tamaño se llena con material de tamaño de poro controlado con precisión. El tiempo de retención del analito aumenta a medida que disminuye el tamaño del analito.
HPLC de intercambio iónico:
La cromatografía de intercambio iónico es un tipo de HPLC que se utiliza para aislar iones y compuestos polares en función de su afinidad por un intercambiador de iones. Para purificar proteínas y otras moléculas cargadas, el IEC es el método más popular, éste es una de las principales ventajas de la cromatografía iónica. IE-HPLC utiliza la atracción por una carga eléctrica en la superficie de partículas en fase estacionaria.
El tiempo de retención de las moléculas eluidas depende de su carga inherente y de la concentración de iones de sal en solución. El intercambio aniónico y el intercambio catiónico son dos tipos de cromatografía iónica. Las partículas de intercambio de aniones son partículas de intercambio catiónico cargadas positivamente que están cargadas negativamente e interaccionan con iones positivos.
Instrumentación de HPLC:
La instrumentación de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) consta de un depósito de disolvente, desgasificador, bomba, bucle de muestra (inyector), columna, horno de columna y detector. La separación de los componentes se produce en la columna HPLC, por tanto se considera un componente clave para la separación en HPLC.
Depósito de disolvente:
Se utiliza para almacenar la fase móvil o disolventes. El HPLC consiste generalmente en fases móviles líquidas polares y no polares como agua, metanol, acetonitrilo y tampón o una combinación adecuada cuya concentración específica cambia en función de las propiedades de la muestra.
Bomba:
Al proporcionar alta presión, la bomba de HPLC proporciona un flujo constante, sin pulso y un flujo reproducible de la fase móvil. Una bomba HPLC estándar debe bombear contra presiones de hasta 6.000 PSI, por tanto, generalmente se utilizan bombas de pistón alternativos a la HPLC. La bomba alterna se utiliza como modo isocrático y de gradiente, y una bomba de jeringa, una bomba neumática se utiliza como modo isocrático. Los distintos tipos de bombas están disponibles como simple, binaria o cuaternaria según sea necesario.
Desgasificador:
El desgasificador al vacío es un componente online que elimina los gases disueltos de los disolventes o de la fase móvil. Dentro del desgasificador en el vacío, el disolvente se mueve a través de un tubo que se encuentra en una cámara de vacío. El vacío parcial dentro de la cámara se mantiene mediante una bomba de vacío que funciona continuamente. El disolvente se mueve dentro de la bobina. Los gases disueltos pasan por el vacío a través de la pared del tubo.
Inyector:
Un inyector de muestra es un dispositivo utilizado para inyectar la solución de muestra en el sistema. Normalmente, el volumen de inyección de la muestra utiliza entre 5 y 100 microlitros. Los inyectores deben tener una alta reproducibilidad y trabajar con la alta contrapresión de HPLC (hasta 4000 psi). Los inyectores de Rheodyne, los inyectores de septum y los inyectores de parada de flujo son ejemplos de inyectores de HPLC, de los que Rheodyne se utiliza habitualmente.
Columna:
La selección de las dimensiones de la columna HPLC para realizar el análisis dependerá de las aplicaciones cromatográficas, propiedades y número de moléculas de la muestra. Por lo general, las columnas modernas están hechas de tubos de acero inoxidable; se empaquetan con geles de sílice esféricos que están recubiertos con una fase estacionaria hidrófoba con un tamaño de molécula de 3 a 10 µm. Las columnas miden unos 50 a 300 mm de largo y las de unos 2 a 5 mm tienen un diámetro.
Horno de columna:
Actualmente el horno de columna en LC es un componente esencial que se utiliza para controlar la temperatura de la columna. Para separaciones de moléculas con la resolución marginal del par de picos críticos, es necesario un adecuado control de la temperatura de la columna. También es útil cuando se utiliza la solución tampón viscosa en la fase móvil.
A medida que la viscosidad disminuye, por consiguiente, la contrapresión del sistema disminuye. Por lo general, cuando la temperatura de la columna aumenta, el proceso de separación cromatográfica se hace más rápido y eficiente.
Detector:
Un detector es una herramienta utilizada para detectar solutos eluidos de la columna HPLC. El detector convierte al efluente en una señal eléctrica y el sistema informatizado lo registra. El detector UV/VIS y PDA son los más utilizados en HPLC; distintos tipos de detectores HPLC son el detector de masa (LC-MS), el detector de fluorescencia y el detector de infrarrojos, etc.
Sistema de adquisición y control de datos:
Cada parámetro del sistema se controla mediante un sistema informatizado. Parámetros de HPLC como composición de la fase móvil, caudal, longitud de onda, tiempo de ejecución, temperatura, secuencia de muestra y volumen de inyección, etc. Se utiliza para controlar constantemente el sistema y comprobar la contrapresión y permite integrar los datos obtenidos.
Preguntas Frecuentes (Preguntas Frecuentes):
¿Qué es el principio HPLC?
El principio básico del HPLC se basa en la distribución de los compuestos entre la fase estacionaria (empaquetamiento de columna) y una fase móvil (solvente). Los compuestos se separan según su estructura química y su afinidad hacia la columna.
¿Dónde se utiliza el HPLC?
El HPLC se utiliza más habitualmente en el campo analítico y en las aplicaciones farmacéuticas. Tiene un papel importante en el análisis farmacéutico, ya que se utiliza para el análisis cualitativo y cuantitativo de muestras de prueba. Otras aplicaciones principales de HPLC incluyen aplicaciones forenses, aplicaciones ambientales, aplicaciones clínicas, aplicaciones de alimentos y bebidas.
¿Por qué se utiliza el detector UV en HPLC?
El detector UV se utiliza en HPLC para detectar e identificar moléculas en la mezcla de muestra. El detector de ultravioleta se basa en la absorbancia UV y funciona en el rango de 200 nm a 400 nm. Es el detector más utilizado para la cromatografía líquida, ya que es no destructivo y mide la cantidad de luz absorbida por la molécula.
¿Por qué se utiliza la columna c18 en HPLC?
Existen diferentes tipos de columnas que se utilizan en la separación por HPLC, pero la columna más utilizada es la C18 (Octildecilsilano). Consta de 18 carbonos unidos a la sílice que es más carbono y una cadena de carbono más larga que otras columnas como C8 o C4. Debido a la cadena de más carbonos, C18 tiene una gran superficie que proporciona más tiempo de interacción entre la fase enlazada y los solutos. En consecuencia, los analitos se eluyen más lentamente de la columna y se produce mayor separación.
¿Qué es la cromatografía en columna?
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