Se utilizan diferentes tipos de columnas de HPLC para separar analitos según la naturaleza, la composición y los modos de separación de HPLC.
La columna es el componente básico en el análisis de cromatografía líquida de alta resolución ya que es responsable de la separación de compuestos. La solución de muestra se mueve a través de la columna con la fase móvil y sale de la columna separándose en sus componentes. Por lo general, el gel de sílice se empaqueta en columnas debido a su porosidad y tamaño de partícula que ayuda a separar los compuestos, y también es un soporte sólido inerte que no reacciona con los solventes. Por lo tanto, las columnas de sílice se utilizan en el análisis de compuestos. La cromatografía líquida se puede clasificar en varios modos. Si la clasificación de la cromatografía depende de la fase estacionaria y la naturaleza del método de separación, puede ser cromatografía de adsorción, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico. Con respecto al primer tipo, existen dos modos de separación basados en la polaridad, que es la cromatografía de fase inversa y la cromatografía de fase normal, estos modos cubren aproximadamente el 90% de todas las aplicaciones de cromatografía.
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| Diferentes tipos de columnas de HPLC |
Hay diferentes tipos de columnas de HPLC disponibles para cromatografía líquida en función de su composición y sistema de separación, vamos a comprobarlo.
Índice temático
Columnas de HPLC de fase inversa:
Columnas de HPLC de fase normal:
Columnas de HPLC de intercambio iónico:
Columnas de HPLC de exclusión por tamaño:
Diferentes tipos de geles en columnas de HPLC:
Columnas de HPLC de fase inversa:
La cromatografía de fase inversa tiene una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. Los hidrocarburos unidos como C8 y C18 y otros hidrocarburos no polares se utilizan en columnas de fase inversa como fase estacionaria, mientras que un disolvente orgánico acuoso como ácido, tampón, metanol, acetonitrilo o una mezcla adecuada de los mismos se utiliza como móvil. fase. El aislamiento de moléculas en columnas de fase inversa a menudo se lleva a cabo dependiendo de la polaridad de la muestra, pero esto es diferente de la columna de HPLC de fase normal, por lo que este tipo de cromatografía se conoce como cromatografía de fase inversa.
Las columnas comúnmente utilizadas en fase inversa son:
- Columnas C18 RP-HPLC
- Columnas C8 RP-HPLC
- Columnas de fase inversa de alquilo
- Columnas de fase reversa de fenilo
- Columnas C4 RP-HPLC
- Columnas RP-HPLC C1
- Columnas C30 RP-HPLC
Columnas de HPLC de fase normal:
La cromatografía de fase normal es un tipo de cromatografía líquida utilizada para el aislamiento de isómeros posicionales complejos que se van a separar en RP-HPLC. La cromatografía de fase normal tiene una fase estacionaria más polar y una fase móvil no polar. Por lo tanto, el soporte sólido de la columna es más polar que el hexano, el agua, el cloruro de metileno, el cloroformo, el éter dietílico o una mezcla de estos utilizados como fase móvil. La separación en la cromatografía de fase normal se basa en la polaridad de los analitos; analitos más polares interactúan más con la fase estacionaria.
Las columnas comúnmente utilizadas en la fase normal son:
- Columnas de sílice en fase normal: son columnas potentes y eficientes para aislar moléculas isoméricas no polares y moderadamente polares.
- Columnas de fase normal amino: Estos tipos de columnas son principalmente útiles para el aislamiento de carbohidratos.
- Columnas de fase normal de ciano: Estos tipos de columnas tienen selectividad opcional y son más rápidas de equilibrar, proporcionando una mejor capacidad de aislamiento de gradiente de fase normal que las columnas de sílice sin ligar.
Columnas de HPLC de intercambio iónico:
Con estas columnas se analizan moléculas que pueden ionizarse rápidamente. En estas columnas, la fase estacionaria permanece ácida o básica para una carga positiva o negativa, mientras que se utiliza una fase móvil polar en forma de solución salina en agua. El aislamiento de componentes tiene lugar entre los componentes y la fase estacionaria cargada dependiendo de la fuerza iónica de atracción. Para la fase estacionaria se utilizan diferentes medios, los grupos cargados inmovilizados más utilizados son trimetilaminoetilo, dietil-2-hidroxipropilaminoetilo, trietilaminoetilo, dietilaminoetilo, aminoetilo, sulfometilo, sulfopropilo y sulfo. El empaquetamiento exitoso de la columna es un aspecto importante de la cromatografía de intercambio iónico. El poliestireno se utiliza para la separación de moléculas pequeñas en aminoácidos como medio. El medio de celulosa se puede usar para aislar solutos grandes porque tienen poros grandes.
Columnas de HPLC de exclusión por tamaño:
La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) también se conoce como cromatografía de filtración en gel. Las columnas de cromatografía de exclusión por tamaño suelen estar rellenas de partículas porosas de poliestireno, divinilbenceno o sílice. Estas columnas se utilizan generalmente para el análisis de polímeros sintéticos en disolventes orgánicos, mientras que para separar biopolímeros se utilizan columnas a base de sílice. La fase estacionaria porosa de estas columnas permite separar los analitos según su tamaño. Los componentes pequeños de la muestra penetran en los poros de la fase estacionaria, mientras que las moléculas más grandes penetran parcialmente en los poros. Por lo tanto, los componentes de muestra más grandes se eluyen más rápido que las moléculas más pequeñas. Generalmente, estas columnas no se utilizan para el análisis de productos farmacéuticos.
Diferentes tipos de geles en columnas de HPLC:
Gel de sílice: El gel de sílice es el material de embalaje más utilizado. Hay dos tipos de geles de sílice disponibles, como los de forma esférica e irregular, entre los cuales los geles de forma esférica son los más utilizados. El gel de sílice que se usa en la cromatografía líquida tiene un poro en la superficie; da un área de superficie más grande que sin agujeros. 5 μm es el tamaño más utilizado, aunque también se utilizan tamaños de gel más pequeños de 1,5 a 3 μm en las columnas de HPLC.
Gel polimérico: Los geles de sílice se usan comúnmente en el desarrollo de HPLC, aunque las columnas basadas en polímeros también son populares. El polietileno y el polipropileno son polímeros comúnmente conocidos para el relleno de columnas. Las columnas de gel de polímero están disponibles en partículas muy pequeñas, como el gel de sílice.
Otro gel: Además de los geles de sílice y polímeros, los geles utilizados incluyen sustancias naturales como celulosa, quitosano, dextrina y cerámica que se utilizan en cromatografía líquida para aislar análisis, pero tienen un uso muy limitado.
La columna es la parte más importante del sistema de HPLC, el aislamiento real de las moléculas de la mezcla de muestra se produce en la columna. Una columna está ubicada después del inyector donde la fase móvil contacta con la fase estacionaria, formando una interfaz con la gran superficie. En los últimos años, el desarrollo de la mayoría de las cromatografías ha contribuido a la creación de varios métodos diferentes para este contacto interfacial. Por lo general, las columnas de RP-HPLC están disponibles en longitudes de 30 a 250 mm, diámetro de 01 a 05 mm y tamaño de poro de 03, 05 y 10 μm.
Las preguntas más frecuentes sobre la cromatografía son las siguientes.
¿Cuántos tipos de HPLC hay?
Según la fase estacionaria del proceso, existen 4 tipos de HPLC, como HPLC de fase normal, HPLC de fase inversa, HPLC de exclusión por tamaño y HPLC de intercambio iónico.
¿Cuál es la diferencia entre las columnas de HPLC C8 y C18?
La principal diferencia entre las columnas C8 y C18 está en sus átomos de carbono. C8 tiene 8 átomos de carbono, mientras que C18 tiene 18 átomos de carbono. C8 tiene una cadena de carbono corta, mientras que C18 tiene una cadena de carbono más larga. C8 tiene un tiempo de retención (RT) más corto, mientras que C18 tiene un tiempo de retención más largo.
¿Qué tipo de detector de HPLC es el más utilizado?
Los detectores UV/VIS y PDA son los detectores más utilizados en HPLC porque ofrecen una sensibilidad superior para los compuestos que absorben la luz.
¿Qué es mejor GC o HPLC?
La cromatografía de gases (GC) es mejor para la separación de compuestos volátiles, mientras que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es mejor para la separación de muestras menos volátiles.
¿Cuál es el principio básico de la cromatografía?
Existen diferentes tipos de cromatografía, aunque funcionan con el mismo principio. Tienen una fase estacionaria y una fase móvil. La fase móvil tiene una mezcla de muestras que se mueve en la fase estacionaria, algunos solutos con afinidad por la fase estacionaria se moverán lentamente, mientras que los solutos que no interactúan con la fase estacionaria se moverán más rápido.
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