Diferentes tipos de detectores HPLC

Se utilizan diferentes tipos de detectores de HPLC para generar una señal proporcional a la cantidad de mezcla de muestra que emerge de la columna de HPLC, permitiendo el análisis cuantitativo de la muestra.

La cromatografía líquida de alto rendimiento es una técnica potente para el aislamiento y determinación cuantitativa de analitos en una mezcla de muestra. El mecanismo HPLC se basa en el principio de la cromatografía de afinidad y consta de dos fases como la fase estacionaria (columna basada en sílice) y una fase móvil (solvente, agua/tampón). La solución de muestra se inyecta en la columna a través del inyector y la fase móvil se bombea a través de una columna a alta presión. La muestra se divide en sus componentes cuando viaja por la columna, cuyos análisis que tienen una baja afinidad por la fase estacionaria se eluden rápidamente de la columna. Un detector detecta los analitos presentes en el elemento procedente de la columna.

La separación de cada analito de la mezcla de muestra se ha realizado dentro de la columna HPLC, aunque esta separación debe permitirnos ver. Cómo, dónde y cuánta separación se produce, necesitamos esta información visual y estadísticamente. Por tanto, utilizamos un detector para este propósito. Se utiliza para controlar y expresar electrónicamente los analitos separados. En la cromatografía líquida de alto rendimiento, se utilizan detectores para detectar el compuesto presente en el eluyente procedente de la columna. Existen diferentes tipos de detectores disponibles para diferentes tipos de cromatografía HPLC, siendo la selección del detector el más importante en la detección de compuestos. El detector se selecciona en función de la sensibilidad del detector para ese compuesto en particular y de la aplicación del análisis.

Algunas de las características importantes necesarias para los detectores HPLC son las siguientes.

Lectura relacionada:

Diferentes tipos de cromatografía HPLC

Un detector debe responder a cada molécula presente en la mezcla de la muestra.
El detector utilizado en el análisis HPLC debe ser no destructivo.
No debería afectar a la respuesta por variaciones en el caudal, la temperatura, la composición de la fase móvil y la presión del sistema.
No debe responder al disolvente o fase móvil utilizados en el análisis.
Debería ser capaz de detectar concentraciones altas y bajas de soluto.
Debería dar una respuesta lineal a concentraciones lineales.
Esto debería producir resultados reproducibles y estables.
No debería afectar a la respuesta de la composición de la fase móvil en la elución isocrática y en gradiente.

Los distintos tipos de detectores de HPLC se clasifican en dos, es decir, detectores de solutos y de propiedades a granel.

A: Detectores de propiedades a granel: En comparación con la fase móvil sola, el detector de propiedades a granel se utiliza para determinar diferencias en la propiedad física del compuesto, por ejemplo, el índice de refracción y el detector de conductividad. La aplicación de detectores de propiedades a granel suele ser universal pero tiene poca sensibilidad y un rango limitado. Este tipo de detectores no son útiles para técnicas como la elución de gradiente, puesto que los resultados se ven afectados por pequeños cambios en la composición de la fase móvil.

B: detectores de propiedades del soluto: Este tipo de detectores son una respuesta a una propiedad química o física determinada. Son de alta sensibilidad, más específicos y poseen un amplio rango de respuesta lineal. Normalmente, deben utilizarse con disolventes muy puros o fases móviles que miden la propiedad. El detector de propiedades del soluto más utilizado es el detector de ultravioleta (UV).

La clasificación de los detectores HPLC es la siguiente.

Lectura relacionada:

¿Qué es una columna HPLC C18?

1. Detector UV/VIS

a. Longitud de onda fija

b. Longitud de onda variable

Lectura relacionada:

Selección de la columna para RP-HPLC

c. Detector de matriz de diodos

2. Detector de masa

3. Detector de fluorescencia

4. Detector de índice de refracción

a. Detector de desviación

b. Detector refractivo

5. Detector electroquímico

6. Detector de conductividad

7. Dispersión de la luz

8. Detector IR

Detectores de propiedades de soluto:

Índice temático

1. Detectores HPLC UV/VIS:
2. Detectores HPLC de matriz de fotodiodos (PDA):
3. Detectores HPLC espectroscópicos de masas:
4. Detectores de fluorescencia HPLC:
1. Detectores de índice de refracción HPLC:
2. Detectores electroquímicos HPLC:
3. Detectores HPLC de conductividad eléctrica:
4. Detectores HPLC de dispersión de luz:

1. Detectores HPLC UV/VIS:

El detector de ultravioleta o visible es el más utilizado en HPLC, ya que ofrece una buena estabilidad, fácil de operar y tiene una buena sensibilidad para moléculas que absorben la luz hasta el nivel de ~pg. Hay tres tipos de detectores en UV/Vis, es decir, detector de longitud de onda fija, detector de longitud de onda variable y detector de matriz de diodos.

Longitud de onda fija: El detector que trabaja en la longitud de onda fija, el de 254 nm, es el más utilizado.

Longitud de onda variable: Los detectores de longitud de onda variable determinan la absorción de la muestra en múltiples longitudes de onda.

Detector de matriz de diodos: El PDA es el detector ampliamente utilizado en HPLC para registrar la absorbancia en el rango del ultravioleta y el visible (UV-VIS).

La absorción UV/Vis es la determinación de la atenuación de un haz de luz después de pasar por una solución de muestra. La determinación de la absorción puede realizarse en una sola longitud de onda o en un rango de longitudes de onda.

2. Detectores HPLC de matriz de fotodiodos (PDA):

PDA es también un detector de UV. Puede detectar múltiples longitudes de onda simultáneamente porque contiene muchos diodos individuales, elementos de resolución o píxeles. Éste es un detector ideal habitual para todo el espectro en un espectrofotómetro dispersivo UV/VIS. Tras pasar por el compartimento de la muestra, se irradia un haz policromático de la fuente en la ranura de entrada del policromador. El policromador dispersa la banda estrecha del espectro en la matriz de diodos. El fotodiodo convierte la luz en señales eléctricas y las almacena por el momento. Los detectores UV o VIS muestran dos dimensiones del resultado obtenido, sin embargo, la matriz de fotodiodos añade la tercera dimensión, es decir, la longitud de onda. Conviene determinar la longitud de onda más adecuada de las moléculas sin repetir el análisis.

3. Detectores HPLC espectroscópicos de masas:

MS es un detector ideal para proporcionar pesas moleculares y estructuras del componente. Un detector de espectroscopia de masas ofrece una alta sensibilidad y selectividad. En el que la detección se basa en la fragmentación molecular por campos eléctricos y la separación se basa en la relación masa-carga de las moléculas fragmentadas. Los compuestos se separan por cromatografía líquida, y las diferentes especies de muestra se vierten en la fuente de iones a presión atmosférica, en la que se transforman en iones en fase gaseosa. El detector de masa detecta la relación masa/carga del ion exponiéndolo a un campo magnético/eléctrico que puede cambiar el movimiento de los iones, lo que les permite clasificar los iones por su masa. Entonces, el detector puede determinar y amplificar la corriente de iones para calcular el número de iones clasificados.

4. Detectores de fluorescencia HPLC:

La principal ventaja de la técnica de fluorescencia es su alta sensibilidad para grupos selectivos de componentes. Los átomos componentes son excitados mediante el uso de una longitud de onda específica y después emiten una señal de luz. La intensidad de la luz emitida se utiliza para medir la concentración de sus componentes. Los componentes que tienen fluorescencia, que puede determinarse por el detector de fluorescencia, para otros componentes que no tienen o tienen una baja absorbancia de fluorescencia, pueden utilizarse derivados de fluorescencia para tratarlos. Muchos materiales naturales, productos farmacéuticos, productos derivados del petróleo y muestras clínicas tienen absorbancia fluorescente.

Detectores de propiedades a granel:

1. Detectores de índice de refracción HPLC:

El detector de índice de refracción mide el índice de refracción de la molécula que atraviesa la celda de flujo. Funciona en dos principios que son la desviación y reflexión de la luz en solución. Existen varios tipos de detectores RI tales como el detector de lente térmica, el detector de efecto Christiansen, el detector de constante dieléctrica y el detector de interferómetro. Este tipo de detectores se utilizan para identificar los analitos no iónicos que en la región UV no son fluorescentes ni absorben.

2. Detectores electroquímicos HPLC:

El detector electroquímico HPLC se utiliza para determinar las moléculas que presentan reacciones de oxidación-reducción y medir las corrientes eléctricas que se producen a partir de estas reacciones. El detector electroquímico tiene una alta sensibilidad y selectividad, puesto que la tensión necesaria para la reacción de oxidación-reducción depende de la molécula. Los detectores de equilibrio y dinámicos son dos tipos de ECD. Este tipo de detectores responde a sustancias oxidables y son sensibles a alteraciones en la composición de la fase móvil ya la velocidad lenta del sistema. La reacción se produce en la superficie del electrodo que genera señales eléctricas. Su idoneidad en la fase móvil acuosa u orgánica puede depender de las características volumétricas del componente. Para llevar a cabo el proceso, necesitan un electrodo auxiliar, un electrodo de referencia y el electrodo de trabajo.

3. Detectores HPLC de conductividad eléctrica:

Los detectores de conductividad se utilizan para determinar la conductividad, por lo que se clasifica como un detector de propiedades a granel. El ion en líquido puede llevar una carga eléctrica bajo la influencia de un gradiente de potencial y, por tanto, si se utiliza una tensión entre dos electrodos situados en el líquido, una corriente viaja entre la solución y los electrodos. Es universal, reproducible y tiene buena sensibilidad de las especies cargadas y de los tensioactivos. La resistencia electrónica medida de la fase móvil o de la muestra es directamente proporcional a la concentración de iones presentes en la solución de la muestra.

4. Detectores HPLC de dispersión de luz:

El detector de dispersión de la luz se utiliza para determinar la luz dispersa que emana del eluyente. Es útil para aquellas moléculas que tienen un gran peso molecular como tensioactivos, lípidos y azúcar. Los tipos de detector de dispersión de la luz son el detector de dispersión de luz láser de ángulo bajo y el detector de dispersión de luz láser de ángulo múltiple. La principal ventaja de un detector de dispersión de luz es que es un detector universal, puede utilizarse con elución de gradiente y no requiere que sea un cromóforo en los analitos para detectarlo.

Otros tipos populares de detectores HPLC son el detector IR, detectores amperométricos pulsados, detectores quirales, detectores basados en aerosoles y detectores de transporte.

Las preguntas más frecuentes sobre la cromatografía HPLC son las siguientes.

¿Cuál es el detector más utilizado en HPLC?

El detector UV se utiliza ampliamente en el análisis de HPLC, puesto que la mayoría de los compuestos absorben en la UV o en la región visible, tiene una buena sensibilidad, fácil de operar y proporcionan una buena estabilidad.

¿Cuál es el factor de desecho?

Para determinar el pico de cola se utiliza el factor de cola en los distintos tipos de cromatografía como HPLC y GC. El factor de final del pico debería ser de 0,9 a 1,4. Tailing 1.0 especifica una forma de pico perfectamente simétrica.

¿Qué diferencia existe entre el detector UV y PDA?

La diferencia clave entre los detectores UV y PDA es que un detector UV puede trabajar en las longitudes de onda específicas mientras que el detector PDA funciona en todo el rango de UV.

¿Qué es la columna de guardia?

La columna HPLC está protegida de impurezas y sólidos en suspensión mediante una columna de protección. Se instala entre el inyector HPLC y la columna. Las columnas de protección se utilizan habitualmente para alargar la vida útil de las columnas analíticas. Normalmente tiene unos 2 cm de largo e incluye un cartucho intercambiable y un diseño de embalaje intercambiable.

Analista de Laboratorio