Principio de HPLC y tipos de cromatografía HPLC

Principio de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC):

El principio de HPLC se basa en la cromatografía de adsorción y partición. Depende de la naturaleza de la fase estacionaria, donde la fase estacionaria es un principio sólido basado en la adsorción y donde la fase estacionaria es un principio líquido basado en la partición.

La HPLC es una técnica de química analítica utilizada para separar, identificar y cuantificar cada soluto presente en una muestra, en función de su interacción con la fase estacionaria y la polaridad. A alta presión, la bomba hace fluir una fase móvil con la mezcla de muestra a través de una columna y permite una mejor separación. Cada componente de la muestra interacciona con el adsorbente (material de embalaje de la columna). El soluto que interacciona fuertemente con la fase estacionaria pasará lentamente por la columna que un soluto con poca interacción. Esta diferencia provoca la velocidad de separación de los distintos componentes.

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Diferentes tipos de cromatografía HPLC:

Hay cuatro tipos de HPLC basados en el sistema de fase (estacionario) en el proceso son los siguientes.

Cromatografía en fase normal:

En este tipo de cromatografía HPLC, se utilizan una fase móvil moderadamente polar y una fase estacionaria polar para separar a los analitos que son libremente solubles en disolventes. En la cromatografía en fase normal, los analitos menos polares eluyen primero que los analitos polares. El uso de disolventes más polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención (Rt) de los analitos. Es mejor para la separación de analitos que difieren en el número de grupos funcionales así como para proteínas.

Cromatografía de fase inversa:

Ésta es una técnica analítica vital de HPLC que se utiliza habitualmente, en la que se utilizan la fase estacionaria no polar y la fase móvil polar. En este método, los compuestos se separan en función de su polaridad. El tiempo de retención es mayor para compuestos más no polares, mientras que los compuestos polares eluyen más fácilmente. Cuanto más hidrófobas sean las sustancias, más fuertemente se adherirán a la columna y mayor será la concentración de disolvente orgánico que se necesitará para eluir los analitos. El RP-HPLC es el más popular porque se aplica en el amplio abanico de moléculas. No puede aplicarse a las proteínas porque el disolvente orgánico provoca la desnaturalización de las proteínas.

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Cromatografía de exclusión de tamaño:

La técnica HPLC de exclusión de tamaño o cromatografía de filtración en gel se aplica para aislar las partículas en función del tamaño. Las moléculas grandes fluyen rápidamente por la columna que las moléculas más pequeñas; es una interacción no absorbtiva con las muestras. Ésta es una técnica analítica vital para determinar el peso molecular de proteínas y polisacáridos.

Cromatografía de intercambio iónico:

La HPLC de intercambio iónico es la más útil para el análisis del agua y la purificación de proteínas. Separa las moléculas polares y los iones, basándose en la similitud con el intercambiador de iones. Se utiliza para cualquier tipo de moléculas cargadas. La cromatografía de intercambio iónico tiene dos tipos, la cromatografía de cationes y la cromatografía aniónica. La cromatografía de intercambio catiónico mantiene la carga positiva y la cromatografía de intercambio de aniones mantiene el anión con el grupo funcional cargado positivamente.

Instrumentación de HPLC:

Los principales componentes implicados en el sistema HPLC son un depósito, bomba, inyector, columna, detector y adquisición de datos.

Depósito de fase móvil: El depósito se utiliza para contener el disolvente o fase móvil, a menudo tiene una botella de vidrio. Puede ser único, binario o cuaternario.
Desgasificador: Se utiliza para eliminar los gases o gases disueltos de la fase móvil.
Bomba: Se utiliza una bomba para mantener un flujo constante de la fase móvil a través del sistema HPLC (por ejemplo, bomba alterna, jeringa y bomba neumática). La composición de la fase móvil del método puede ser isocrática o gradiente.
El inyector (bucle de muestra): Se coloca antes de la columna y se utiliza para introducir un volumen variable y reproducible de la muestra (p. ej. Rheodyne, septum, stop-flow). Puede ser manual o de muestreo automático.
Columna: La columna está formada por partículas (generalmente gel de sílice) que se conoce como fase estacionaria. Es un componente clave puesto que es responsable de la separación de los solutos. Algunos de los tipos de columnas HPLC son las columnas C8, C18-octadecilsilano, ciano, amino, de intercambio iónico, etc.
Horno de columna: Actualmente es un componente necesario en HPLC que se utiliza para controlar la temperatura de la columna, que es necesaria para las moléculas sensibles y el tampón viscoso.
Detector: El detector se utiliza para detectar el compuesto presente en el eluyente que proviene de la columna. Debe ser no destructivo, altamente sensible y cubrir un amplio rango molecular. Algunos de los ejemplos son UV-Vis, detección de fotodiodo-array (PDA), fluorescencia e índice de refracción, etc.
Sistema de adquisición de datos: Se utilizaba para controlar/ajustar los parámetros de funcionamiento, almacenar datos y realizar cálculos como el área del pico, altura, número de placa teórica, cola y frente, etc.

Las principales ventajas del HPLC:

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La HPLC se utiliza para la separación y el análisis de mezclas muy complejas que no son posibles con otras técnicas convencionales.
El HPLC proporciona un método sencillo, automatizado y altamente preciso para reconocer a determinados componentes químicos.
La cantidad mínima de disolvente o fase móvil necesaria para el proceso.
En comparación con otros métodos cromatográficos, como la cromatografía en papel, la cromatografía de capa fina (TLC) y la cromatografía en columna, es muy rápido y ofrece alta resolución.
Puede actualizarse a cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) para proporcionar información sobre el peso molecular y la estructura de compuestos específicos.

El análisis repetitivo y reproducible puede ser posible mediante una única columna HPLC.

Las principales aplicaciones de HPLC:

El HPLC es ahora una de las herramientas más potentes de la química analítica que se utiliza en muchas aplicaciones tanto para su cuantificación como para su identificación. El HPLC se aplica en productos farmacéuticos, medioambientales, ciencias farmacéuticas, forense, diagnóstico clínico, industrias alimentarias, purificación de agua, fines de investigación, agricultura, y también lo utilizan diversas industrias para el análisis y para mantener la calidad de los productos.