Cómo Funciona la Reacción en Cadena de la Polimerasa para Amplificar Genes

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica genética molecular para hacer múltiples copias de un gen y también forma parte del proceso de secuenciación de genes.

Cómo Funciona la Reacción en Cadena de la Polimerasa

Las copias de genes se hacen usando una muestra de ADN, y la tecnología es lo suficientemente buena como para hacer múltiples copias de una sola copia del gen que se encuentra en la muestra. La amplificación por PCR de un gen para hacer millones de copias, permite la detección e identificación de secuencias génicas utilizando técnicas visuales basadas en el tamaño y la carga (+ o -) de la pieza de ADN.

En condiciones controladas, se generan pequeños segmentos de ADN mediante enzimas conocidas como ADN polimerasas, que añaden desoxinucleótidos complementarios (DNTP) a una pieza de ADN conocida como "molde"."Incluso piezas más pequeñas de ADN, llamadas "cebadores", se usan como punto de partida para la polimerasa.

Los cebadores son pequeñas piezas de ADN hechas por el hombre (oligómeros), generalmente de entre 15 y 30 nucleótidos de largo. Se hacen conociendo o adivinando secuencias cortas de ADN en los extremos del gen que se amplifica. Durante la PCR, el ADN que se está secuenciando se calienta y las cadenas dobles se separan. Al enfriarse, los cebadores se unen al molde (llamado recocido) y crean un lugar para que comience la polimerasa.

La Técnica de PCR

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue posible gracias al descubrimiento de termófilos y enzimas polimerasas termófilas (enzimas que mantienen la integridad estructural y la funcionalidad después de calentar a altas temperaturas). Las etapas implicadas en la técnica de PCR son las siguientes:

• Se crea una mezcla, con concentraciones optimizadas del molde de ADN, enzima polimerasa, cebadores y DNTP. La capacidad de calentar la mezcla sin desnaturalizar la enzima permite la desnaturalización de la doble hélice de la muestra de ADN a temperaturas en el intervalo de 94 grados Celsius.
• Después de la desnaturalización, la muestra se enfría a un intervalo más moderado, alrededor de 54 grados, lo que facilita la hibridación (unión) de los cebadores a los moldes de ADN monocatenario.
• En la tercera etapa del ciclo, la muestra se recalienta a 72 grados, la temperatura ideal para la ADN polimerasa Taq, para el alargamiento. Durante el alargamiento, la ADN polimerasa usa la cadena sencilla original de ADN como molde para añadir DNTP complementarios a los extremos 3' de cada cebador y generar una sección de ADN bicatenario en la región del gen de interés.
• Los cebadores que se han hibridado con secuencias de ADN que no son una coincidencia exacta no permanecen hibridados a 72 grados, lo que limita la elongación del gen de interés.

Este proceso de desnaturalización, hibridación y elongación se repite múltiples (30-40) veces, aumentando así exponencialmente el número de copias del gen deseado en la mezcla. Aunque este proceso sería bastante tedioso si se realizara manualmente, las muestras se pueden preparar e incubar en un termociclador programmable, ahora común en la mayoría de los laboratorios moleculares, y se puede realizar una reacción de PCR completa en 3-4 horas.

Cada etapa de desnaturalización detiene el proceso de elongación del ciclo anterior, truncando así la nueva hebra de ADN y manteniéndola aproximadamente al tamaño del gen deseado. La duración del ciclo de elongación puede hacerse más larga o más corta dependiendo del tamaño del gen de interés, pero eventualmente, a través de ciclos repetidos de PCR, la mayoría de los moldes se restringirán al tamaño del gen de interés solo, ya que se habrán generado a partir de productos de ambos cebadores.

Hay varios factores diferentes para una PCR exitosa que se pueden manipular para mejorar los resultados. El método más ampliamente utilizado para ensayar la presencia de producto de PCR es la electroforesis en gel de agarosa. Que se usa para separar fragmentos de ADN en función del tamaño y la carga. Los fragmentos se visualizan a continuación usando colorantes o radioisótopos.

La Evolución

Desde el descubrimiento de la PCR, se han descubierto ADN polimerasas distintas de la Taq original. Algunos de estos tienen una mejor capacidad de "corrección de pruebas" o son más estables a temperaturas más altas, mejorando así la especificidad de la PCR y reduciendo los errores de la inserción del dNTP incorrecto.

Algunas variaciones de la PCR se han diseñado para aplicaciones específicas y ahora se usan regularmente en laboratorios de genética molecular. Algunos de estos son PCR en Tiempo Real y PCR con Transcriptasa Inversa. El descubrimiento de la PCR también ha conducido al desarrollo de la secuenciación del ADN, la huella dactilar del ADN y otras técnicas moleculares.