Métodos para la Purificación de Proteínas en Biotecnología

Un componente importante de la investigación biotecnológica es el uso de técnicas de ingeniería de proteínas para diseñar o modificar proteínas. Estas técnicas de purificación de proteínas optimizan las propiedades de las proteínas para aplicaciones industriales específicas.

Estas técnicas requieren que los científicos aíslen y purifiquen proteínas de interés para que se puedan estudiar sus conformaciones y especificidades de sustrato. También requieren estudio las reacciones con otros ligandos (una proteína que se une a una proteína receptora) y actividades enzimáticas específicas.

El grado de pureza de proteína requerido depende del uso final previsto de la proteína. Para algunas aplicaciones, un extracto crudo es suficiente. En otros usos, como en alimentos y productos farmacéuticos, se requiere un alto nivel de pureza. Se usan varias técnicas para la purificación de proteínas para alcanzar un nivel de pureza requerido.

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Desarrolle una Estrategia

Cada etapa de purificación de proteínas normalmente da como resultado algún grado de pérdida de producto. Por lo tanto, una estrategia de purificación de proteínas ideal es aquella en la que el nivel más alto de purificación se alcanza en el menor número de etapas.

La selección de qué etapas usar depende del tamaño, la carga, la solubilidad y otras propiedades de la proteína diana. Las siguientes técnicas son las más apropiadas para purificar una única proteína citosólica.

Diagrama de Flujo del Método Científico

La purificación de complejos proteicos citosólicos es más complicada y normalmente requiere la aplicación de diferentes métodos.​

Preparar un Extracto Crudo

La primera etapa en la purificación de proteínas intracelulares (dentro de la célula) es la preparación de un extracto crudo. El extracto contendrá una mezcla compleja de todas las proteínas del citoplasma celular y algunas macromoléculas, cofactores y nutrientes adicionales.

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Este extracto crudo puede usarse para algunas aplicaciones en biotecnología. Sin embargo, si la pureza es un problema, se deben seguir las etapas de purificación posteriores. Los extractos de proteínas brutas se preparan mediante la eliminación de residuos celulares generados por lisis celular, que se logra utilizando productos químicos, enzimas, sonicación o una prensa francesa.

Retire los Residuos del Extracto

Los residuos se eliminan por centrifugación, y se recupera el sobrenadante (el líquido por encima de un residuo sólido). Las preparaciones brutas de proteínas extracelulares (fuera de la célula) se pueden obtener simplemente eliminando las células por centrifugación.

Para ciertas aplicaciones biotecnológicas, existe una demanda de enzimas termoestables, enzimas que pueden tolerar altas temperaturas sin desnaturalizar, mientras mantienen una alta actividad específica.

Los organismos que producen proteínas resistentes al calor a veces se denominan extremófilos. Un enfoque fácil para purificar una proteína resistente al calor es desnaturalizar las otras proteínas en la mezcla calentando, luego enfriando la solución (permitiendo así que la enzima termoestable se reforme o redisuelva, si es necesario). Las proteínas desnaturalizadas se pueden eliminar luego por centrifugación.

Etapas Intermedias de Purificación de Proteínas

Los protocolos biotecnológicos modernos a menudo aprovechan los muchos kits o métodos disponibles comercialmente que proporcionan soluciones listas para usar para procedimientos estándar. La purificación de proteínas se realiza a menudo usando filtros y columnas de filtración en gel preparadas.

Siga las instrucciones del kit de diálisis y agregue el volumen correcto de la solución correcta y espere el período de tiempo especificado mientras recoge el eluyente (el solvente pasado a través de la columna)en un tubo de ensayo nuevo.

Utilizar Métodos Cromatográficos

Los métodos cromatográficos se pueden aplicar usando columnas de sobremesa o equipos de HPLC automatizados. La separación por HPLC se puede realizar mediante métodos de fase inversa, intercambio iónico o exclusión por tamaño, y las muestras se detectan mediante una matriz de diodos o tecnología láser. ​

Emplear Precipitación

En el pasado, una segunda etapa común para purificar una proteína a partir de un extracto crudo era mediante precipitación en una solución con alta fuerza osmótica (es decir, soluciones salinas). La precipitación de proteínas se realiza habitualmente usando sulfato de amonio como sal. Los ácidos nucleicos en el extracto crudo se pueden eliminar precipitando agregados formados con sulfato de estreptomicina o sulfato de protamina.

La precipitación de sal no conduce habitualmente a una proteína altamente purificada, pero puede ayudar a eliminar algunas proteínas no deseadas en una mezcla y concentrando la muestra. Las sales en la solución se eliminan luego por diálisis a través de tubos de celulosa porosos, filtración o cromatografía de exclusión en gel.

Diferentes proteínas precipitarán en diferentes concentraciones de sulfato de amonio. En general, las proteínas de mayor peso molecular precipitan en concentraciones más bajas de sulfato de amonio.

Visualización de Proteínas y Evaluación de la Purificación

La cromatografía de fase inversa (RPC) separa las proteínas en función de sus hidrofobicidades relativas (exclusión de moléculas no polares del agua). Esta técnica es altamente selectiva pero requiere el uso de disolventes orgánicos.

Algunas proteínas se desnaturalizan permanentemente por disolventes y perderán funcionalidad durante la RPC. Por lo tanto, este método no se recomienda para todas las aplicaciones, particularmente si es necesario que la proteína diana retenga actividad.

Intercambio Iónico

La cromatografía de intercambio iónico se refiere a la separación de proteínas en función de la carga. Las columnas pueden prepararse para intercambio aniónico o intercambio catiónico. Las columnas de intercambio aniónico contienen una fase estacionaria con una carga positiva que atrae proteínas cargadas negativamente.

Intercambio Catiónico y Filtración en Gel

Las columnas de intercambio catiónico son las perlas inversas cargadas negativamente que atraen proteínas cargadas positivamente. La elución (extracción de un material de otro) de la proteína o proteínas diana se realiza cambiando el pH en la columna, lo que da como resultado un cambio o neutralización de los grupos funcionales cargados de cada proteína.

Cromatografía de Exclusión por Tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño (también conocida como filtración en gel) separa las proteínas más grandes de las más pequeñas, ya que las moléculas más grandes viajan más rápido a través del polímero reticulado en la columna de cromatografía. Las proteínas grandes no encajan en los poros del polímero, mientras que las proteínas más pequeñas sí, y tardan más en viajar a través de la columna de cromatografía, a través de una ruta menos directa.

Tiempo de Elución

El eluato (el resultado de la elución) se recoge en una serie de tubos que separan proteínas en función del tiempo de elución. La filtración en gel es una herramienta útil para concentrar una muestra de proteína, ya que la proteína diana se recoge en un volumen de elución más pequeño que el que se añadió inicialmente a la columna. Podrían usarse técnicas de filtración similares durante la producción de proteínas a gran escala debido a su rentabilidad.

Cromatografía de Afinidad y Electroforesis

La cromatografía de afinidad es una técnica muy útil para "pulir" o completar el proceso de purificación de proteínas. Las perlas en la columna de cromatografía se reticulan con ligandos que se unen específicamente a la proteína diana.

A continuación, la proteína se retira de la columna enjuagando con una solución que contiene ligandos libres. Este método da los resultados más puros y la actividad específica más alta en comparación con otras técnicas.

PÁGINA DE SDS

SDS-PAGE (dodecilsulfato de sodio usado con electroforesis en gel de poliacrilamida) se une a proteínas dándoles una gran carga negativa neta. Dado que las cargas de todas las proteínas son bastante iguales, este método las separa casi por completo en función del tamaño.

La SDS-PAGE se usa a menudo para probar la pureza de la proteína después de cada paso de una serie. A medida que las proteínas no deseadas se eliminan gradualmente de la mezcla, el número de bandas visualizadas en el gel de SDS-PAGE se reduce, hasta que solo hay una banda que representa la proteína deseada.

Inmunotransferencia

La inmunotransferencia es una técnica de visualización de proteínas aplicada en combinación con cromatografía de afinidad. Los anticuerpos para una proteína específica se usan como ligandos en una columna de cromatografía de afinidad.

La proteína diana se retiene en la columna, luego se elimina enjuagando la columna con una solución salina u otros agentes. Los anticuerpos unidos a marcadores radiactivos o colorantes ayudan en la detección de la proteína diana una vez que se separa del resto de la mezcla.