Ensayo de Reducción de Nitratos - Laboratoryinfo.com

¿Qué es una Prueba de Reducción de Nitratos?

Es un procedimiento que diferencia los miembros de Enterobacteriaceae en base a la capacidad de producir la enzima nitrato reductasa que a su vez hidroliza el nitrato a nitrito y eventualmente se degradará a diferentes productos de nitrógeno, tales como óxido nitroso, óxido de nitrógeno y amoníaco.

Otros usos de la prueba de reducción de nitrato son los siguientes:

• Ayuda a diferenciar especies de micobacterias.
• La prueba de reducción de nitrato puede ayudar a identificar especies de Neisseria y separarlas de otras especies como Moraxella y Kingella.
• Ayuda a diferenciar N. gonorrea de K. desnitrificantes.
• Ayuda a identificar especies de Corynebacterium. ^{(1, 2 y 3)}

Imagen 1: Cuatro tubos de ensayo; el primero está sin inocular, el segundo tubo de ensayo no tiene zinc, el tercero tiene zinc, y el último tubo de ensayo se vuelve rojo después de agregar un polvo de zinc.

Fuente de la Imagen: germsandworms.files.wordpress.com

Imagen 2: La imagen muestra el resultado de la prueba de reducción de nitrato.

Fuente de la Imagen: slideplayer.com

¿Cuál es el objetivo de la prueba de reducción de nitratos?

El objetivo principal de la prueba de reducción de nitrato es verificar la capacidad del organismo para producir la enzima nitrato reductasa.

Al realizar la prueba, será fácil diferenciar miembros de Enterobacteriaceae que tienen la capacidad de producir nitrato reductasa de organismos gramnegativos que no producen dicha enzima. ^{(3, 4)}

Principio de la prueba de reducción de nitratos

En el entorno anaeróbico, algunos microorganismos tienen la capacidad de reducir sales de nitrato como KNO3 a una sal de nitrito. El proceso se denomina respiración anaeróbica en la que la molécula de nitrato sirve como aceptor de electrones.

El nitrato reacciona con los reactivos A y B provocando un color rojo debido a la formación de colorante azoico. En algunos casos, algunos microorganismos pueden reducir aún más los nitritos a nitrógeno y amoníaco libres

El período de incubación

Un inóculo de un organismo que se está ensayando se incuba en un caldo de nitrato. Se debe incubar durante cuatro horas y se verifica la reducción de nitrato a nitrito en el caldo. Se realiza añadiendo reactivo de ácido sulfanílico y α-naftilamina.

Si el microorganismo que se está analizando ha reducido el nitrato a nitrito, notará la formación de ácido nitroso. Si agrega ácido sulfanílico, alcanzará y producirá ácido sulfanílico diazotizado, que luego reaccionará con α-naftilamina formando un compuesto de color rojo.

Cambios de color:

El organismo que se está ensayando para la reducción de nitrato es positivo si el medio se vuelve rojo después de añadir reactivos de nitrato. Si no hay cambios en el color del medio después de agregar el reactivo, significa que el organismo que se está probando no tiene la capacidad de reducir el nitrato. También puede significar que el organismo ha desnitrificado nitrato o nitrito para crear amoníaco o nitrógeno molecular.

Si no hay cambios en el color del medio, debe continuar con el siguiente paso, que es agregar una pequeña cantidad de zinc en polvo. Si el medio se vuelve rojo, indica que hay nitrato no reducido, lo que indica que el resultado es un verdadero negativo.

Tenga en cuenta que si el medio no se vuelve rojo después de agregar polvo de zinc, significa que el resultado de la prueba de reducción de nitrato es positivo completo. ^{(4, 5, 6 y 7)}

Razones por las que el cultivo no produjo un color rojo:

• El organismo que se está probando no ha logrado reducir los nitratos.
• El organismo que se está ensayando tiene una potente nitrato reductasa que conduce a una reducción adicional del nitrato a amoníaco o N2 molecular.

Nota:

Se necesitan pruebas adicionales simplemente agregando una pequeña cantidad de polvo de zinc al cultivo. Lo que hace el polvo de zinc es reducir los nitratos a nitritos.

Esté atento a los cambios de color. Si el color cambia a rojo después de agregar polvo de zinc, significa que el nitrato no se redujo. ^{(7, 8 y 9)}

¿Cuáles son los materiales necesarios para la prueba de reducción de nitratos?

• Medio: caldo de nitrato con tubo Durhams invertido
• Reactivo
  • Reactivo de alfa-naftilamina
  • Reactivo de ácido sulfalínico
  • Polvo de zinc
• Quemador
• Bucle de inoculación
• Gotero
• Organismo sometido a ensayo
• Incubadora ⁽¹⁰⁾

¿Cómo se realiza una prueba de reducción de nitrato?

1. La primera etapa es inocular caldo de nitrato con un crecimiento de organismo que se está ensayando usando un método estéril.
2. Incubar.
3. Añadir una gota de ácido sulfanílico y una gota de reactivo de alfa naftilamina al caldo.
4. Si el color cambia a rojo, significa que el organismo que se está analizando es positivo para una prueba de reducción de nitratos. ^{(3, 6 y 7)}

Paso adicional:

Si el cultivo no se vuelve rojo después de agregar el reactivo necesario, debe realizar el siguiente paso, que es agregar zinc en polvo. Verifique cuidadosamente los cambios de color. Si el color cambia a rojo, significa que el organismo que se está analizando es negativo para la prueba de reducción de nitratos. ^{(2, 5)}

Imagen 3: Dos tubos de ensayo; uno es positivo en la prueba de reducción de nitrato y el otro es negativo en la prueba de reducción de nitrato.

Fuente de la Imagen: amazonaws.com

Interpretación de resultados:

• Negativo – La prueba de reducción de nitrato es negativa si el color del medio no cambió. Significa que el nitrito está ausente. Sin embargo, se debe realizar otro paso para confirmar si el resultado es un verdadero negativo. ¿Por qué? Debido a que algunos organismos tienen la capacidad de reducir aún más el nitrato a nitrito a otra molécula. Por lo tanto, debe agregar una pequeña cantidad de zinc en polvo al caldo. Lo que hará el zinc es catalizar la reducción de nitrato a nitrito. Si el color del medio cambia a rojo, significa que el resultado es un verdadero negativo. Si no se produce ningún cambio de color después de agregar zinc en polvo, significa que el resultado es positivo.
• Positivo – Una prueba de reducción de nitrato es positiva si el color cambia a rojo cereza después de agregar el reactivo. Si se tomó la etapa adicional, tal como la adición de un polvo de zinc, el resultado es positivo si el color del medio no se vuelve rojo después de la adición de polvo de zinc. ^{(3, 6 y 8)}

Medidas de seguridad

Los reactivos alfa naftilamina y ácido sulfalínico son venenosos y pueden ser extremadamente dañinos y fatales cuando se ingieren. Estos reactivos deben manipularse bien y no deben estar en contacto con la piel, los ojos y el tracto respiratorio, ya que son altamente corrosivos.

Si los reactivos entran en contacto con sus ojos, debe enjuagarse inmediatamente con agua y buscar ayuda médica. Por otro lado, el polvo de zinc es extremadamente inflamable una vez que entra en contacto con el agua.

Al almacenar zinc en polvo, debe asegurarse de que se almacene en un recipiente bien cerrado y seco. En caso de incendio, no utilice agua. Puede extinguir el fuego con arena o dióxido de carbono. ^{(1, 5 y 9)}

Referencia

1. https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/content/hugo/nitratereagent.htm
2. https://microbeonline.com/nitrate-reduction-test-principle-procedure-results/
3. https://www.cdc.gov/std/gonorrhea/lab/tests/nitrate.htm
4. http://www.biologypractical.com/nitrate-reduction-test-objective-principle-procedure-and-result/
5. https://microbenotes.com/nitrate-reduction-test-objectives-principle-procedure-and-results/
6. https://catalog.hardydiagnostics.com/cp_prod/content/hugo/nitratereagent.htm
7. https://en.wikipedia.org/wiki/Nitrate_reductase_test
8. https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/73426?lang=en& región=PH
9. http://www.asmscience.org/content/education/protocol/protocol.3660
10. http://www.vumicro.com/vumie/help/VUMICRO/Nitrate_Reductase_Test.htm